防己茯苓汤治疗射血分数保留型心力衰竭的作用机制

周健，邵正斌，戚先伟，付玉轩，陈虹，徐海娟，汤忠富，李舒

1 安徽中医药大学 安徽合肥 230038 2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031 3 安徽中医药科学院心血管病研究所 安徽合肥 230031

流行病学调查显示，我国住院的31356例慢性心力衰竭患者中[1]，射血分数保留型心力衰竭（Heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）患 者约占43.0%，我国HFpEF患者在心衰患者中占比较高，目前，西医在治疗HFpEF主要采用利尿剂、醛固酮受体拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂等药物缓解症状，在降低HFpEF的发病率和死亡率方面尚缺乏有效的手段[2]。

HFpEF对应中医心衰，中医对于心衰的治疗可追溯到两千多年前，《内经》中“夫不得卧，卧则喘者，是水气之客也”是对于心衰症状及病机最早的阐述[3]。《金匮要略》中“皮水为病，四肢肿，水气在皮肤中，四肢聂聂动者，防已茯苓汤主之”，防已茯苓汤有渗湿利水、健脾和胃、宁心安神的作用，由防己、黄芪、桂枝、茯苓、甘草等五味药物组成。2016年《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》[4]中建议使用防己茯苓汤治疗心衰以通阳利水。本研究以防己茯苓汤为研究对象，利用网络药理学及分子对接多成分、多靶点、多通路的研究思路探究该药治疗HFpEF的物质基础以及作用机制，为后续的研究提供依据。

资料与方法

1 活性成分的挖掘与筛选

利 用TCMSP数 据 库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）进行文献检索，收集防己茯苓汤各个药物的成分。并选择符合口服生物利用度（OB）值≥30%和药物相似性（DL）值≥0.18的成分，作为其活性成分，删除重复数据，并整理记录。

2 活性成分-靶点网络构建

通过TCMSP平台进行检索，将整理好的活性成分查找对应的活性靶点蛋白，利用数据库 UniProt（https：//www.uniprot.org）规范化翻译配对靶点名称，将物种选择规定为人类（HUMAN），得到对应的基因靶点。

3 HFpEF疾病的靶点收集

在GeneCards（https：//www.genecards.org）、Dis-GeNET（https：//www.disgenet.org）、中 以“Heart failure with preserved ejection fraction”为关键词进行检索，获得HFpEF的疾病靶点，去重整理后获得HFpEF疾病的靶点。

4 活性成分对应疾病靶基因确定

将上述得到的成分-基因靶点、疾病-基因靶点，导入 Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），得到药物和疾病共同靶点韦恩图，得到并整理防己茯苓汤有效活性成分调控HFpEF靶基因的网络节点。

5 蛋白质互作网络

使用 STRING 软件（https：//string-db.org）对药物和疾病二者的交集靶点进行蛋白互作（PPI）网络构建，设置信度 score≥0.400 并隐藏游离节点，获取 TSV 数据，导入至 Cytoscape 3.9.1 软件进行可视化分析，并利用插件Network Analyzer分析网络节点Degree值，筛选出节点 Degree 值排名前20的节点作为核心靶点。

6 交集基因 GO 和 KEGG 富集分析

将药物和疾病的交集靶点导入 Metascape 平台（http：//metascape.org/gp/index.html），设置 P＜0.01，限定物种为“Homo sapiens”，并对其进行GO和KEGG富集分析，导出相关数据，将数据进行处理后，使用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn）进行可视化处理。

7 防己茯苓汤主要活性成分与核心靶点分子对接

利用TCMSP数据库下载防己茯苓汤主要活性成分的mol2格式，使用AutoDock Tools 1.5.7处理防己茯苓汤主要活性成分后保存为“pdbqt”格式，作为分子对接配体；在 PBD 蛋白数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下载核心靶点蛋白结构，运用 PyMol 软件去除受体蛋白的水分子及原小分子配体，用 AutoDock Tools 1.5.7添加非极性氢与电荷后保存为“pdbqt”格式，作为分子对接受体。运用 AutoDock Vina进行分子对接，导入配体和受体，设置合适的对接盒子，生成相应的的构象，去除未生成氢键的构象，选择能量最低的构象作为最佳结合构象，保存为 PDB 格式后用 Pymol 3将防己茯苓汤关键活性成分与核心靶点对接结果进行可视化处理。

防己茯苓汤有效成分筛选及靶点预测

通过 TCMSP平台检索，整理出防己茯苓汤活性成分，得到活性成分为：防己3个，茯苓15个，黄芪20个，桂枝7个，甘草92个，统计重复后整理为128个。将128个活性成分，通过 UniProt规范化翻译配对靶点名称，将物种选择规定为人类（HUMAN），排除无对应靶点及无人类基因靶点后，去重后得到全方候选靶点227个见表1。

表1 防己茯苓汤活性成分-靶点预测结果

1 防己茯苓汤及HFpEF靶基因网络节点

以“Heart failure with preserved ejection fraction”为检索词，在数据库GeneCards以及DisGeNET进行检索，排除重复值，获得HFpEF基因 1377个，将上述得到的活性成分基因，疾病基因，导入 Venny2.1，整理得到防己茯苓汤有效成分与HFpEF靶基因的交集靶点为123个见图 1。确定防己茯苓汤有效成分调控HFpEF靶基因的网络节点。

图1 防己茯苓汤与HFpEF Venn图

2 “药物-活性成分-靶点”网络图分析

使用 Cytoscape 3.9.1 对 123 个交集靶点进行“药物-活性成分-靶点”网络图的绘制，见图 2。利用插件Network Analyzer分析网络节点Degree值，得到338个节点，1778条边，节点的颜色的明暗和大小依据 degree 值而设定，degree 值越大，节点的颜色越深，面积越大。

图2 “药物-活性成分-靶点”网络图

图中蓝色菱形的图标代表交集靶点，绿色圆形图标代表中药，其中FJ、FL、HQ、GZ、GC分别是防己、茯苓、黄芪、桂枝、甘草的简写，外周六边形图标代表防己茯 苓汤的活性成分，其中A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、B1、C1成分代表中药的共有成分，见表2。

表2 防己茯苓汤药物共有成分表

3 防己茯苓汤与HFpEF交集靶点PPI 网络图分析

将 123个“交集靶点”导入STRING 数据库，获取 PPI 网络图及相关的数据文件，将数据初筛后导入 Cytoscape3.9.1 进行直观的拓扑分析，得到 122 个节点，2400 条边，节点的大小和颜色的明暗依据 degree 值而设定，degree 值越大，节点的颜色越深，面积越大；边线条的粗细由 Combined Score 值决定，Combined Score 越高连线越粗，见图3。将 degree 值排名前20的蛋白筛选出来，见图4，防己茯苓汤可能主要通过这些靶点治疗 HFpEF，认为这些靶点是防己茯苓汤治疗HFpEF的核心靶点。

图3 防己茯苓汤治疗HFpEF靶点PPI网络

图4 PPI网络中degree值排名前20的靶点

4 防己茯苓汤与HFpEF交集靶点GO 和 KEGG 富集分析

运用Metascape数据平台对防己茯苓汤和HFpEF的交集靶点进行GO和KEGG富集分析。运用微生信平台进行可视化处理后得到如下KEGG分析图和GO分析图，见图5、图6。可见交集靶点参与的生物学过程（BP）主要包括细胞对脂质的反应、对激素的反应、细胞对有机环状化合物的反应、细胞迁移的积极调节、对氧气水平的响应、调节细胞粘附、血液循环、细胞群增殖的负调节、调节凋亡信号通路等。防己茯苓汤与HFpEF交集靶点主要分子功能（MF）富集在RNA聚合酶II特异性DNA结合、细胞因子受体结合、肾上腺素能受体活性、转录因子结合、蛋白质均质二聚活性、蛋白酶结合等。“交集靶点”细胞组分（CC）富集在膜筏、转录调节因子复合物、受体复合物、囊泡腔、细胞外基质、膜的侧面、早期内体、内质网腔、核信封、细胞质的核周区域等。KEGG 富集分析进一步解释了防己茯苓汤治疗HFpEF的潜在机制，通过分析发现参与的通路主要有PI3K-Akt信号通路、血脂与动脉粥样硬化通路、HIF-1信号通路、钙离子信号通路、P53信号通路等通路，这些通路可能是防己茯苓汤治疗HFpEF的关键通路。此外还有癌症通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路等通路，表明防己茯苓汤可能参与相关疾病的调节。

图5 防己茯苓汤和 HFpEF“交集靶点”的 KEGG 富集分析

图6 防己茯苓汤和HFpEF“交集靶点”的GO富集分析

5 防己茯苓汤主要活性成分与核心靶点分子对接

通过分子对接技术对网络药理学结果进一步分析，筛选网络中度值较高的有效成分和靶点进行对接，对防己茯苓汤中有效成分治疗HFpEF的能力进行预测打分。根据图 2分析结果，在选择度值的情况下同时考虑每个药物，故筛选来自防己的MOL002341（Hesperetin，橙 皮 素），来 自 茯 苓 的 MOL000296（hederagenin，常春藤素），来自黄芪的MOL000098（quercetin，槲皮素），来自桂枝的MOL000358（betasitosterol，β-谷 甾 醇），来 自 甘 草 的MOL000422（kaempferol，山柰酚），这5个成分作为对接配体。根据图 4 分析结果，选取AKT1、IL6、TNF、TP53、CASP3度值排名前5的核心靶点作为对接受体，用结合能（Affinity ）来评估成分与靶点的结合能力，结合能＜0 表明可以自由结合，结合能越低表明配体与受体之间的亲和力越大，二者发生相互作用的可能性就越高。由于数据较多，故展示排名前 20 位的对接结果，见表3。利用 Pymol 软件对部分分子对接结果进行可视化处理，见图 7，其中蓝色为蛋白受体，绿色为小分子配体，黄色虚线为配体与受体之间形成的氢键，表示配体与受体之间的结合较稳定。分子对接结果显示成分与靶点能够较好结合。

图7 Vina 部分分子对接模式图

表3 防己茯苓汤关键活性成分与核心靶点分子对接结果（前 20 名）

讨论

1 防己茯苓汤治疗HFpEF药效成分分析

网络药理学研究结果显示，防己茯苓汤的有效活性成分为128个，发挥治疗HFpEF的关键成分有槲皮素、山柰酚、橙皮素等。

槲皮素是一种植物衍生代谢物，属于黄酮类化合物，具有抗炎、保护心脏、抗糖尿病、抗动脉粥样硬和抗凋亡活性等作用[5]。研究表明，槲皮素可以通过减轻炎症反应、延缓心室重构、降低心肌细胞损伤，以此来改善慢性心力衰竭大鼠的心功能[6-7]。

山柰酚是一种天然黄酮醇类黄酮，具有抗炎、保护心脏功能、预防癌症、保护颅神经等作用[8]。Feng等人[9]指出，山奈酚通过对ASK1/MAPK信号通路的抑制和氧化应激的调节防止心脏肥大，从而保护小鼠心脏和H9c2细胞免受病理性氧化应激。

橙皮素及其衍生物在治疗心力衰竭和心脏重塑，心肌缺血和梗死以及高血压方面具有疗效[10]。研究表明[11]，橙皮素可以通过抑制小鼠中NF-κB信号通路的激活，从而降低小鼠炎症细胞因子水平及心脏纤维化的可能。本研究结果与上述研究报道相符，说明防己茯苓汤在治疗HFpEF具有多成分共同作用的特点。

2 防己茯苓汤治疗HFpEF关键靶点分析

依据网络药理学及分子对接结果，发现 AKT1、IL6、TNF、TP53、CASP3等靶点可能是防己茯苓汤治疗HFpEF的关键靶点。

AKT1是AKT的一种亚型。AKT[12]是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是参与多种细胞过程的信号转导途径中的关键酶。研究表明[13]，AKT1能增加细胞大小，减少细胞凋亡，并被认为对心力衰竭有益。AKT激活心脏保护作用，促凋亡蛋白功能的阻断和保护性信号通路的启动。AKT信号对心肌细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、及心肌成纤维细胞存活具有重要意义[14]。在起搏引起的心力衰竭中，AKT活性下降也与细胞凋亡增加有关[15]。

IL-6是先天免疫的关键细胞因子，它具有一套广泛的生理功能，与宿主防御，免疫细胞调节，增殖和分化有关[16]。IL-6通过与IL-6受体结合，形成的IL-6受体复合物作用于心肌细胞中的GP130信号转导受体，产生负性肌力作用以及细胞毒性作用，通过改变心肌纤维的排列结构，发生心肌重塑，从而诱发心力衰竭[17]。

TNF是一种多效性细胞因子，是炎症中的重要细胞因子。对哺乳动物心肌细胞的实验研究表明，TNF 发挥直接的肌力负作用，降低心肌细胞的活力，增强心肌纤维化和心室肥大。TNF的过度表达导致对β肾上腺素能刺激和心脏重塑的反应降低[18]。此外TNF的慢性刺激会增加其他促炎细胞因子的形成，例如IL-6和IL-1，它们也参与慢性心力衰竭的发病机制[19]。

3 防己茯苓汤治疗HFpEF作用机制分析

对防己茯苓汤与HFpEF交集靶点进行富集分析发现，它们可能参与调控了PI3K-Akt信号通路、血脂与动脉粥样硬化通路、HIF-1信号通路、钙离子信号通路、P53信号通路等通路。以及对脂质的反应、对氧气水平的响应、血液循环、细胞群增殖的负调节、调节凋亡信号等生物过程。

PI3K-AKt信号通路在心血管疾病、肿瘤、代谢紊乱、肾脏疾病中发挥着重要的作用。研究表明[20]，PI3K-AKT信号通路可能通过通路参与血管形成、调节代谢、激活炎症、影响钙离子循环蛋白、调控细胞凋亡自噬等方式作用于心力衰竭。PI3K-Akt信号通路通过调控细胞存活、凋亡、生长、心肌收缩，甚至相关基因的转录，参与调节心肌纤维化的发生、发展和病理形成[21]。

HIF-1信号通路明是心脏代谢发育变化的关键调节通路之一。调节范围包括基因转录、蛋白质稳定性和蛋白质相互作用，对缺氧环境的反应范围从多样化的细胞调节到系统性回应[22]。心力衰竭、动脉粥样硬化等心血管疾病中均有组织缺氧的表现，调控 HIF-1 信号通路可减轻机体缺氧状态。

p53信号通路主要为转录因子发挥作用，并诱导多种分子诱导凋亡，阻止细胞生长、抑制血管生成、DNA修复功能、调节衰老等。p53被认为是适应各种有害刺激的关键分子，包括缺氧、氧化应激、感染等。研究表明[23]，p53信号通路在心衰、动脉硬化、细胞衰老、新陈代谢中起着关键作用。

综上，本研究采用网络药理学，发现防己茯苓汤可能通过槲皮素、山柰酚、橙皮素等关键成分，作用于AKT1、IL-6、TNF、TP53、CASP3等靶点，通过参与血管形成、调控细胞凋亡自噬、调节代谢、影响钙离子循环蛋白等作用，从而治疗HFpEF。本研究可为防己茯苓汤治疗HFpEF及其他相关疾病的研究及临床应用提供一定的参考依据。