半夏泻心汤治疗结直肠癌的作用机制探讨*

乐音子，丁天雯，顾云慧，颜帅，谢金

南京中医药大学附属苏州市中医医院 江苏苏州 215009

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是临床常见的消化道恶性肿瘤，其发生率及死亡率分居全球恶性肿瘤第4位及第3位[1]。因其发病机制复杂，现有的根治性手术、化疗等疗法对部分组织器官产生不可逆损伤和化疗耐药，在治疗上带给结直肠医师诸多困难与不利[2-3]。国内外多个Meta分析表明中医药联合化疗是结直肠癌综合治疗的重要武器，已取得长足 进步[4-5]。

张仲景所创的经典名方半夏泻心汤显示出无可比拟的临床优势，全方寒温并用、辛开苦降、补泻兼施，是治疗痞证的代表方，文献分析总结发现半夏泻心汤在辅助晚期及术后CRC患者化疗协同增效[6]、防治CRC化疗患者口腔黏膜炎[7]、恶心呕吐[8]、延迟性腹泻[9]方面疗效显著。基础实验研究表明半夏泻心汤通过诱导肿瘤细胞凋亡[10]、调控 PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制癌细胞的增殖和转移[11]发挥抑瘤作用。单一的体内外实验难以反映经典复方治疗CRC涉及多成分、多靶点特点，本研究旨在通过网络药理学方法获取半夏泻心汤的活性成分，筛选核心靶标基因和通路，构建力求从系统层面探讨其治疗结直肠癌可能的作用机制，为经典名方在临床应用和后续再研发提供参考和依据。

材料与方法

1 半夏泻心汤的成分收集

在TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库中筛选出符合OB≥30%和DL≥0.18的活性成分，查找与半夏泻心汤成分相关的文献进行成分补充。

2 靶点的选择

筛选出TCMSP数据库提供的作用靶点，用Uniprot（http：//www.uniprot.org/）数 据 库 进 行 靶 点基 因 转 化，在DisGeNET（http：//www.disgenet.org/search）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库中搜索“colorectal cancer”关键词，查找与结直肠癌相关的疾病基因。使用Venny平台匹配后获得半夏泻心汤治疗结直肠癌的核心靶点。

3 核心靶点与疾病的关联度及类型归属

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）数 据库的VarElect模块中导入半夏泻心汤的核心靶点，设定病名为“colorectal cancer”，进而获得核心靶点与疾病的关联度。在DisGeNET（http：//www.disgenet.org/search）平台中查找核心靶点的类型归属。

4 核心靶点蛋白相互作用的网络构建

将半夏泻心汤的核心靶点导入String数据库（https：//stringdb.org/Version 10.5）中，研究的物种限制为人类，下载相关数据后在Cytoscape软件中绘制蛋白质互作网络模型。

5 药物-活性成分-核心靶点-通路-疾病的网络构建

将数据结果导入Cytoscape软件中构建“药物-活性成分-核心靶点-通路-疾病”的网络模型。其中node代表半夏泻心汤、活性成分、核心靶点、信号通路以及结直肠癌疾病，edge用来连接上述节点。通过构建该网络模型进一步展示了半夏泻心汤治疗结直肠癌的作用机制。

6 核心靶点生物功能和通路的分析

将半夏泻心汤10个核心靶点导入DAVID数据库中，“background”限定为人类，选择GO和KEGG Pathway富集模块后开始分析。根据P值和靶点数量选出合适的富集结果，并运用Oring软件将富集结果可视化。

结果

1 半夏泻心汤活性成分的筛选

通过TCMSP 数据库获得半夏泻心汤的化学成分1058个，通过限定OB≥40%，DL≥0.18后获取半夏泻心汤中以药物成分吸收的候选活性成分121个，见表1。

表1 半夏泻心汤中部分主要的活性成分

2 半夏泻心汤治疗结直肠癌的核心靶点

在TCMSP数据库中获得半夏泻心汤2376个靶标基因，合并剔除后共获得247个作用靶点，在Genecards和DisGeNET数据库中共筛选出和结直肠癌相关的靶点204个，运用Venny平台进行匹配后获得10个半夏泻心汤治疗结直肠癌的核心靶点，见 图1。

图1 半夏泻心汤治疗结直肠癌的核心靶点

3 核心靶点与疾病的关联度及类型归属

将10个核心靶点导入VarElect平台中获得核心靶点与疾病的关联度，结果可见TP53、CCND1、AKT1与疾病关联度相对较高；在DisGeNET平台中进行核心靶点类型归属，显示半夏泻心汤治疗结直肠癌过程主要涉及到了转录因子、信号分子、氧化还原酶等物质，见表2。

表2 半夏泻心汤活性成分靶点信息

4 核心蛋白质相互作用的网络分析

将半夏泻心汤治疗结直肠癌的10个核心靶点导入String数据库中获得蛋白质相互作用数据，并在Cytoscape软件中可视化。结果显示该网络共有10个节点和32条边。Degree值用node的大小和颜色深浅表示，combine score值用edge的粗细表示，排名较前的靶蛋白为TP53、AKT1、CCND1。该网络提示半夏泻心汤的核心靶点通过相互协同增强防治结直肠癌，见图2。

图2 半夏泻心汤的蛋白质相互作用网络

5 核心靶点生物功能和通路的分析

利用DAVID数据库对半夏泻心汤活性成分对应的潜在靶标基因进行GO和 KEGG分析。GO分析显示半夏泻心汤10个核心靶点的生物过程主要为细胞凋亡过程的调节、细胞增殖的负调节、炎症反应、端粒酶活性的负调节等，见图3；分子功能主要涉及酶结合、蛋白质合成、转录调节区DNA结合、蛋白质磷酸酶2A合成等，见图4；细胞组分主要涉及细胞质、线粒体、蛋白质复合物等，见图5。KEGG通路富集分析显示半夏泻心汤治疗结直肠癌的靶标基因主要富集癌症的途径、P53信号通路、细胞凋亡、AMPK信号通路、鞘脂信号通路等，见图6。上述结果显示半夏泻心汤的核心靶点富集在多个生物功能和通路内，提示半夏泻心汤可通过协调多种途径来发挥治疗结直肠癌的作用。

图3 GO富集分析生物过程

图4 GO富集分析分子功能

图5 GO富集分析细胞组分

图6 KEGG通路富集分析结果

6 “成分-靶标-通路网络”的构建分析

将半夏泻心汤、活性成分、核心靶点、主要通路和结直肠癌导入Cytoscape软件中构图，结果显示在半夏泻心汤的121个活性成分中，与核心靶点相连的有99个，与主要通路相关的靶点有6个。其中排名较前的活性成分为槲皮素、山奈酚、柚皮素、甘草查尔酮A。排名较前的靶点为PTGS2、PPARG、AKT1、BAX，主要的通路为P53信号通路、神经营养因子信号通路、AMPK信号通路，上述结果表明半夏泻心汤是通过多成分、多靶点、多通路的防治结直肠癌，见图7。

图7 半夏泻心汤成分-靶标-通路多维网络

讨论

本文借助靶标预测、网络构建、GO富集和通路富集分析相结合的网络药理学手段从系统层面探究半夏泻心汤治疗结直肠癌的作用机制，为下一步的基础研究提供理论支持。

本研究所收集的半夏泻心汤治疗结直肠癌的主要活性成分有121个，其中人参、半夏、黄芩、大枣活性成分共为豆甾醇；黄连、甘草、大枣活性成分共为槲皮素；人参、甘草活性成分共为山奈酚；人参、大枣活性成分共为蓝堇碱（原阿片碱）和malkangunin；人参、黄芩活性成分共为邻苯二甲酸二异辛酯；黄连、黄芩活性成分共为表小檗碱；甘草、大枣活性成分共为Mairin（丁子香萜）；大枣、黄连活性成分共为Moupinamide穆坪马兜铃酰胺。其中有临床常用药对（人参与甘草、甘草与大枣、人参与黄芩、黄连和黄芩）的口服候选活性成分占据前十位，是半夏泻心汤中发挥重要作用的主要药对，可能与目前半夏泻心汤中君臣佐使配伍有一定关系。豆甾醇是植物甾醇的一个组分，具有多种生物活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤[12]；药理研究表明豆甾醇可显著抑制人结肠癌细胞Caco-2、HT-29、SW480细胞增殖[13]。槲皮素作为一种膳食类黄酮，可通过下调Bcl-2、C-myc的表达水平抑制SW480细胞增殖[14]；还可择性地激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）途径抑制含有突变型或野生型KRAS的CRC细胞的增殖[15]。山奈酚通过激活ROS和p53介导的p38磷酸化和caspase凋亡通路诱导HCT116细胞亚G1期，G2/M期阻滞，增加TUNEL细胞的数量[16]。

本研究中“成分-靶标”互作网络体现了半夏泻心汤多成分、多靶点治疗结直肠癌的特点，作用机理复杂。核心靶点与疾病分子对接结果提示半夏泻心汤活性成分和关键靶标之间关联度良好，证实网络药理学结果具有颇高的参考价值。结果同时发现，半夏泻心汤治疗结直肠癌的121个潜在靶标基因，主要功能靶标涉及 PTGS2、PPARG、AKT1、BAX等；GO富集显示细胞凋亡和增殖等生物过程；蛋白质合成等分子功能。KEGG 信号通路富集分析提示与癌症的途径、P53信号通路、AMPK信号通路等密切相关。近年来越来越多的研究表明环氧合酶2（PTGS2）参与结直肠癌的形成、侵袭、转移过程[17]，PPARG与许多致癌和肿瘤抑制途径相互作用，这些途径可能改变PPARG表达对生存的影响[18]；Akt1可能参与结直肠癌的发生发展和转移，其表达情况有助于判断结直肠癌的恶性程度和预后[19]；Bax基因高表达是大肠癌细胞自噬的负调控因子[20]，文献研究藤黄酸提高Bax/Bcl-2水平抑制SW480、LOVO细胞增殖并诱导凋亡[21]。由此可知，半夏泻心汤中主要活性成分槲皮素、山奈酚、柚皮素、甘草查尔酮A通过作用于PTGS2、PPARG、AKT1、BAX等靶标，调控P53信号通路、神经营养因子信号通路、AMPK信号通路等防治结直肠癌。

综上，本研究依托网络药理学技术为进一步开发经典名方半夏泻心汤基础实验指明方向，避免盲目的资源浪费。然而所有数据结果均基于公开数据库和已发表文献，无法涵盖半夏泻心汤中所有化学成分全部的信息；忽视单味饮片之间互相作用产生的新的化学成分；加上人体结直肠癌发生发展是一个动态复杂的过程，因此后续课题组将从基因组学、代谢组学相关的多组学技术联合采用相关生物技术进一步阐明半夏泻心汤防治CRC的作用机制。