补阳还五汤治疗腰椎间盘突出症的作用机制

邓梦，关永林，马斌祥，张洋，常斌，姚鹏程

1 甘肃中医药大学 甘肃兰州 730000 2 甘肃省中医院 甘肃兰州 730000

LDH是椎间盘退变、纤维环破裂、髓核突出，刺激或压迫神经根或脊髓引起的以腰腿痛为主要症状的综合征[1]。研究表明，我国LDH发病率达7.62%，是造成第三位经济负担的疾病[2]。LDH包括手术治疗和保守治疗，但手术治疗仅少数病情严重患者采用，多数患者采用保守治疗，目前西药保守治疗短期效果较好，但存在较强毒副作用且作用短、费用昂贵、易复发等缺点[3]。

LDH属于中医“腰痛” “痹证”等范畴，病位在肾、肝，病性是瘀、湿、寒、气滞[4]，《诸病源候论》记载：“肾气不足，受风邪之所为也，劳则伤肾，虚则受于风冷，风冷与正气交争，故腰脚痛”、“夫劳伤之人，肾气虚损，而肾主腰脚，其经贯肾络脊，风邪乘虚，卒入肾经，故卒然而患腰痛”[5]，治疗以补肾活血祛瘀为主。中医药在LDH的治疗中有不可替代的作用，其中补阳还五汤能补气活血通络，有效缓解患者的症状，原方出自《医林改错》，用于治疗气虚血瘀之中风，方中黄芪使气旺以促血行；当归活血通络；赤芍、川芎、桃仁、红花活血祛瘀；地龙通经活络，引诸药力直达络中，全方共奏补气、消瘀、 通络之功[6]。本文利用网络药理学相关原理及方法，探讨补阳还五汤治疗LDH的分子机制，并利用分子对接技术进行初步验证，为补阳还五汤用于治疗LDH的进一步实验研究及临床应用提供参考。

资料和方法

1 补阳还五汤有效成分筛选及靶点预测

通过检索TCMSP数据库挖掘补阳还五汤中赤芍、川芎、当归、地龙、红花、黄芪、桃仁成分及作用靶点，根据成分毒药物动力学（ADME）参数筛选有效成分，将药物口服生物利用度 （OB）≥30%、药物相似度（DL）≥0.18定义为筛选条件[7]，利用Uniprot数据库[8]完成靶点的基因名称标准转换。

2 LDH疾病相关靶点获取

通过OMIM、DrugBank、GeneCards等疾病数据库，以“Lumbar disc herniation”为关键词检索LDH相关靶点，合并删除重复值，得到LDH疾病相关靶点。

3 补阳还五汤潜在治疗靶点获取

将复方靶点及疾病靶点导入网站Bioinformatics & Evolutionary Genomics进行venn分析，获得药物与疾病交集靶点，认为是复方潜在治疗靶点。

4 PPI网络分析

将潜在靶点输入STRING数据库[9]，构建PP网络； 结果导入至Cytoscape3.7.1通过network analyzer插件分析网络中的节点度值（Dgree），节点颜色和大小代表节点度值，其节度值越大代表其在网络中作用越重要，将节度值前12位定义为补阳还五汤的关键治疗靶点。

5 生物富集分析

将潜在靶点利用RStudio的“clusterProfiler”包进行GO功能和KEGG 通路富集分析，设定P＜0.05，利用“ggplot2”包对显著富集结果进行作图。

6 疾病-中药-成分-靶点-信号通路网络构建

根据1.3和1.5分析结合1.1和1.2的检索，构建疾病-中药-成分-靶点-信号通路图，并进行网络特征分析，明确各节点之间的相互作用关系。

7 分子对接验证

将关键靶点及化合物进行分子对接，验证其相互作用活性。蛋白质晶体结构从PDB 数据库下载，化合物从PubChem数据库下载。利用Chem3D对化合物进行能量最小化处理，PyMol对蛋白质晶体去水、去除杂质配体处理，利用AutoDockTool对蛋白质晶体及化合物进行加氢、加电荷处理后转为PDBQT格式，利用AutoDockVina进行分子对接，提取对接结果，利用PyMol对结合能力较强的进行作图[10]。

结果

1 补阳还五汤有效成分及作用靶点预测

获得药物有效成分共90个，其中赤芍29个，川芎7个，当归2个，红花22个，黄芪20个，桃仁23个（未查找到地龙相关化合物，故舍弃），利用TCMSP进行有效成分靶点预测，具有作用靶点的化合物共62个，对其进行编码，见表1。

表1 中药有效成分及编码

2 补阳还五汤及LDH相关靶点预测

通过检索，获得补阳还五汤靶点245个，LDH靶点503个，将药物靶点与疾病靶点取交集获得共同靶点58个，代表补阳还五汤的潜在治疗靶点，绘制venn图，见图1。

图1 药物-疾病venn图

3 PPI分析

将潜在靶点上传STRING绘制PPI网络图，将结果利用可视化软件分析，共58个节点，1948条作用关系，Dgree值靠前为IL6、IL1B、TNF等，代表补阳还五汤治疗LDH的关键靶点，图2。

图2 PPI网络图

续表1

4 生物富集分析

得到GO条目1358 条，其中生物学过程（BP）3308条、分子功能（MF）291条以及细胞组分（CC）185条，显著富集结果如图3所示。潜在治疗靶点涉及的 BP 主要包括对脂多糖的反应、对氧化应激的反应、细胞对化学、生物、环境刺激的反应以及细胞增殖的调节、炎症反应等。

图3 GO分析气泡图

涉及KEGG通路211条，具有明显统计学差异包括：糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、查加斯病、脂质与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子信号通路、松弛素信号通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、癌症中的蛋白多糖、类风湿性关节炎、百日咳、结直肠癌、前列腺癌、人巨细胞病毒感染、利什曼病、膀胱癌、Toll样受体信号通路、肺结核、内分泌抵抗，绘制气泡图，如图4。

图4 KEGG分析气泡图

5 疾病-中药-成分-靶点-通路网络构建

补阳还五汤有效成分-疾病-潜在靶点-通路网络见图5，共148个节点，686条作用关系，补阳还五汤中多个化合物成分，能通过作用于多个靶蛋白调节多条信号通路，达到治疗LDH的目的。

图5 疾病-中药-成分-靶点-通路图

6 分子对接结果

关键靶点与化合物分子对接结果见表2，纳入结合能＜-5.0 kcal/mol的对接结果，对对接活性强的前5组进行绘图，见图6。补阳还五汤中有效化合物能深入靶蛋白活性位点，并与其关键氨基酸残基形成极性或非极性键，以稳定配体和受体的结合[10]。

表2 分子对接结果

图6 分子对接结果展示

讨论

补阳还五汤是治疗气虚血瘀症的代表方，临床上能抗炎、减少神经细胞凋亡、促进神经纤维修复，治疗LDH有较好效果[11]。姜文淼[12]等发现补阳还五汤联合艾灸能减轻炎症反应、缓解疼痛、改善腰椎功能。裘兴栋[13]等表明电针联合补阳还五汤能下调软骨终板中VEGF、IL-1β表达水平，增加软骨终板内血管芽数目、降低钙化层厚度，延缓椎间盘退变。本文利用网络药理学方法，分析补阳还五汤治疗LDH的成分及靶点、相关生物学过程，筛选出补阳还五汤中有效成分62个，作用靶点248个，潜在治疗LDH靶点58个。

PPI显示，补阳还五汤关键靶点包括IL6、IL1B、TNF等。IL-1β、TNF、IL-6 为促炎细胞因子，IL6参与急性炎症反应和神经系统疼痛机制，通过激活MAPK/ERK、成骨分化、STAT3和β-连环蛋白等信号通路以及干预TIMP-1的活性影响椎间盘功能[14-15]，IL-1β在IVDD期间导致炎症、基质降解、氧化应激和细胞凋亡，通过干预NF-KB/p65信号通路，调节髓核细胞中的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达[16-17]；TNF-α增加血管通透性，促进破骨细胞增殖，诱导髓核细胞凋亡，引起IVDD[18-19]；AKT1作为一种促生存激酶，调节细胞凋亡、血管损伤[20]；MMP9通过调节细胞外基质降解参与IVDD进程，与血液-脊髓屏障、更高的通透性和中性粒细胞迁移等过程有关[21-22]；VEGF能增加微血管通透性、促进血浆纤维蛋白外渗形成血管、为细胞迁移提供纤维网络，诱导椎间盘组织血管生成及浸润[23]；PTGS2参与炎症、凋亡和免疫反应、细胞因子和趋化因子的级联反应，调控破骨细胞与成骨细胞的生成和分化[24]；TP53和CASP3诱导细胞凋亡和衰老[25]，趋化因子CCL2、CXCL8在椎间盘突出的疼痛机制中发挥重要作用[26]。

可视化分析及分子对接结果表明，山奈酚（Kaempferol）、黄芩素（Baicalein）、β谷甾醇（beta-Sitosterol）、槲皮素（Quercetin）化合物等与关键靶点结合能力较强，可能是补阳还五汤治疗LDH的关键成分，均有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫调节等药理活性，现代药理学研究表明，槲皮素通过调控PI3K/AKT、NF-κB等信号通路抑制细胞炎症过程[27]；蔡美云[28]等实验研究表明，山奈酚通过激活p38/ MAPK信号通络发挥抗炎和神经保护作用，邹雪莲[29]等研究表明山奈酚作为Nrf2激活剂参与氧化应激反应，提高细胞对氧化损伤的保护作用；黄芩素可通过上调miR-29a-3p的表达来抑制MAP2K6的磷酸化，以提高骨细胞活性、抑制细胞凋亡[30]；β-谷甾醇能提高OPG与ODF的比值，调节骨代谢平衡，调控VEGF抑制滑膜血管生成，减少关节肿胀和破坏，具有免疫调节、镇痛抗炎等作用[3，31]。

生物富集分析表明，补阳还五汤治疗LDH涉及多条信号通路，其中与LDH关系密切的包括：糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路等。AGEs和RAGE的组合可以激活NF-KB、丝裂原激活的蛋白激酶或JAK/STAT途径，以参与炎症、增殖和运动，同时AGE-MG-H1的积累与IVDD中软骨内骨化、肥大和成骨分化有关[25-32]，TNF和IL-17途径在IVDD的进展中起着协同作用，主要通过促进炎症因子的释放、NPC的凋亡和ECM的降解[25]，IL-17A通过促进炎症反应、加速ECM降解、诱导血管生成和新神经支配来影响IDD，也可以降低、调节IDD细胞的自噬水平[33]。TNF信号通路刺激破骨细胞分化和活化，引起骨丢失，刺激滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生降解软骨的蛋白酶，导致关节和软骨的破坏[34]，Toll样受体（TLRs）能通过NF-κB、MAPK等通路调控基质降解酶、TNFα、IL等炎症因子参与IVDD，有研究在小鼠的椎间盘中注射MyD88抑制剂后，能够消除炎性介质LPS、IL-1B等引起的TLR2上调，并可降低MMP1、MMP13、 ADAMTS4和ADAMTS5的 表 达，证 明 了TLR2通过MyD88依赖途径参与了IDD[35]。

综上所述，补阳还五汤通过山奈酚、黄芩素、β谷甾醇、槲皮素等化合物通过AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路等通路，调控IL6、IL1B、TNF、AKT1、MMP9、VEGFA PTGS2、TP53、JUN、CASP3等、CCL2、CXCL8等细胞因子和趋化因子的表达，调节炎症反应、氧化应激、血管生成、髓核细胞增殖和凋亡的LDH相关生物过程。本研究初步挖掘补阳还五汤治疗LDH的分子作用机制，可以为进一步实验验证提供参考和借鉴。