“黄芪-牛膝”药对治疗糖尿病足的作用机制研究*

郑佳，吴鹏，王一兵

1 山东中医药大学 山东济南 250014 2 济南市组织工程皮肤再生与创面修复临床医学研究中心 山东济南 250014

糖尿病足（diabetic foot，DF）是因糖尿病引起下肢神经系统疾病及不同程度的血管病变，随病情的进展在足部产生溃疡，伴或不伴感染[1]，是糖尿病一种严重的并发症，影响了患者的生活质量。随着时代发展和生活水平的提高，糖尿病率越来越高，人们对并发症的关注也随之增加，但是目前尚未有彻底治愈的方法；随着足部溃疡患者治疗周期长，给患者带来了一定的经济负担，而中医药在治疗是具有安全在、有效、经济的特点，已被很多医家接受。中医学认为DF属“脱疽”“脚疽”范畴。

药物配对使用是中药常用的应用形式之一，“黄芪-牛膝”药对来源于治疗脚疽的经典方顾步汤。黄芪药性甘，微寒，归脾、肺经，具有行滞通痹、生津养血、敛疮生肌、利水消肿、脱毒排脓等功效。黄芪是滋补良药，被称之为“疮家圣药”。研究发现，黄芪能够控制创面的感染，促进肉芽组织的形成[2-3]，缩短创面愈合的时间，作用机理可能与促进成纤维细胞的增殖、胶原合成、抑制细胞凋亡和延缓细胞衰老相关[4-7]。牛膝药性苦、甘、酸、平，归肝、肾经，具有利尿、补肝肾、强筋骨、逐瘀通经的功效。最初记录于《神农本草经》，谓其“主寒湿痿痹，四肢拘挛，膝痛不可屈伸，逐血气，伤热火烂，堕胎。久服轻身耐老。”经现代药理学研究证明，牛膝可通过阻止IL-1β诱导的IκBα降解和磷酸化表现出抗炎作用[8]，有可能与调控TGF-β1/Smad通路相关[9]，牛膝多糖能够增强体液免疫功能，能够抑制细胞凋亡和抗氧化作用[10-12]，由此可见“黄芪-牛膝”在治疗DF中的重要作用。目前对黄芪和牛膝的研究已有不少深入研究，但在治疗DF方面的靶点尚研究不足，而中药在人体多组分、多靶点、多途径等特点与网络药理学系统分析的方式相契合[13]，故本研究通过运用网络药理学和分子对接技术的方法，预测这两种中药治疗DF的靶点及通路，探究其可能的作用机制，为今后深入研究提供理论基础和依据。

材料与方法

1 黄芪-牛膝成分及作用靶点获取

在TCMSP数据库平台（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、HERB（drug.ac.cn）分别以黄芪和牛膝为关键词检索，下载它们的化学成分及作用靶点，并以口服生物利用度（OB） ≥ 30%、类药性（DL） ≥ 0.18为条件，筛选出活性成分及潜在靶点；利用 UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/uploadlists）和R语言软件将靶点的基因名称标准化。

2 糖尿病足靶点的检索

以“diabetic foot” 为关键词分别在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https：//www.omim.org/）及Pharmgkb（https：//www.pharmgkb.org）这四个数据库检索获取疾病靶点，同时运用 R 语言软件将所得靶点进行整合，剔除重复靶点。

3 药物与糖尿病足共同靶点筛选

将之前获取的药物作用靶点与DF的作用靶点运用 R 语言软件绘制药物与DF的共同靶点并绘制韦恩图。

4 共同靶点蛋白互作网络构建及可视化

将药物与DF的共同靶点导入SRTING数据库（https：//string-db.org）中，设置选择“multiple proteins”“homo sapiens”，设置隐藏游离点（hide discon-nected nodes in the network），在 minimum required interaction score中选择highest confidence（0.400），更新下载蛋白互作网络（PPI）高清图和TSV文件。将下载的TSV格式文件导入Cytoscape3.8.2软件进行相关参数设置后得到 “药物成分-糖尿病足靶点”的调控网络图。

5 GO功能及KEGG通路富集分析

利用R语言软件将共同靶点的symbol转换为基因ID；并对共同靶点进行GO 与KEGG 富集分析。GO分析可获得共同靶点的生物学过程（BP）、细胞组分（CC）及分子功能（MF），并将富集度高的以条形图呈现；KEGG分析获得靶点富集程度较高的信号通路，并以条形图呈现。

6 成分-靶点分子对接验证

为了探究结果的可靠性，对药物成分和靶点蛋白进行分子对接验证。在Pub Chem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取成分的小分子配体2D结构，然后将其用ChemOffice 软件制作成3D结构；从 PDB 数据库（https：//www.rcsb.org）中下载靶点蛋白基因的3D结构，用PyMOL 2.5.1软件去除水分子和小分子配体后，再使用Auto Dock 软件将得到的活性成分及核心蛋白基因转换为pdbqt 格式，确定活性口袋，用脚本进行对接。将结果用PyMol 2.5.1软件进行可视化处理。

结果

1 黄芪-牛膝成分及作用靶点检索结果

在TCMSP 及HERB数据库获得符合条件的有效成分共48个，其中黄芪有效活性成分25个，牛膝有效活性成分23个，删除重复成分后共46个，见表1；药物成分作用靶点779个，经 UniProt 注释并去重后剩余 207个药物作用潜在靶点。

表1 黄芪-牛膝药用成分

2 糖尿病足疾病靶点检索结果

在分别在GeneCards数据库获得416个靶点，TTD获得17个靶点，Pharmgkb获得24个靶点，OMIM数据库获得95个靶点，经 R 语言软件删除重复靶点后剩余 486个。

3 药物与疾病共同靶点筛选结果

运用R 语言软件筛选得到药物与DF共同靶点有56个，见图1A。

图1 黄芪-牛膝作用于糖尿病足靶点筛选

4 蛋白互作网络（PPI）的构建及可视化分析

为了进一步了解蛋白见间的相互作用关系，将“黄芪-牛膝”与DF的共同靶点导入STRING数据库中进行分析得到PPI网络关系图，节点代表靶点蛋白，边代表靶点蛋白的关系，线条越多表示该蛋白越重要，如图1B所示。关系图中共有56个节点，782条边，平均节点度为27.9。将所得TSV格式文件利用Cytoscape软件进行可视化分析，相关设置后绘制出“药物成分-糖尿病足靶点”网络关系图，如图2。Degree值越大则图形越大，在其种发挥的作用也越重要，可见药物成分种Degree值最大的是MOL000098（quercetin）和MOL000422（kaempferol），靶点基因种Degree值较大的是PTGS2、AR、NOS2、ADRB2、ESR1。

图2 药物成分-靶点网络图

5 药物与DF的GO功能及KEGG通路富集分析

将药物与DF的共同靶点利用R语言进行GO分析后总共得到2201个功能，其中BP有2017条，CC有35条，MF有149条，并将在BP、CC、MF富集度最高的前20个功能绘制成条形图（见图3A），图形颜色越红表示基因在该功能富集度越高；R语言进行KEGG通路富集分析后可得到141条相关通路，将富集度最高的30条通路绘制成条形图（见图3B）。颜色由红到蓝，颜色越红代表该通路富集的基因率越高，校正后的P值也越小。

图3 交集靶点富集分析 （A）GO富集分析，包括生物进程，细胞组分，分子功能 （B）KEGG通路分析

6 核心成分与关键靶点的分子对接

从“药物成分-糖尿病足靶点”网络图中选择基因靶点degree值最高关键靶点（PTGS2、AR、NOS2）分别与主要化学成分（槲皮素、山奈酚）进行分子对接，将对接结果可视化得到如图4。对接最低结合能如表2所示。

表2 核心成分与关键靶点的分子对接

图4 分子对接模型示意图

讨论

DF是糖尿病严重的并发症之一，糖尿病人体内异常的代谢环境也使得其患病率显著提高，创面的难以愈合对患者的生活质量和心理都产生不良的影响。中医药黄芪和牛膝在治疗创面方面均有研究报道其效果明确，值得进一步的研究，且中医药经济实惠，在长期治疗时给患者带来的经济负担较少。

本研究在TCMSP数据库筛选出“黄芪-牛膝”的46个活性成分，在疾病相关数据库得到DF靶点486个，映射后最终得到22个活性成分作用于56个DF靶点。从“药物成分-糖尿病足靶点”网络关系图中可知槲皮素、山柰酚、黄芩素等是“黄芪-牛膝”治疗糖尿病足种发挥重要作用的化学物。槲皮素是一种类黄酮化合物，现已有研究发现其具有抗炎，抗氧化等多种药理活性[14-16]。槲皮素[17]可以促进成纤维细胞的增殖和迁移能力，通过抑制TNFα、IL1β、IL6等炎症因子增加小鼠生长因子的表达来有效促进创面的愈合。炎症细胞因子的产生与巨噬细胞M1和M2表型的极化密切相关，Fu等人[18]发现槲皮素可以通过调节巨噬细胞极化从M1转向M2表型来抑制炎症反应，促进糖尿病伤口的愈合。此外，在一项实验研究中发现[19]嵌入槲皮素和油酸的纳米水凝胶处理与透明质酸治疗相比，显着减少了伤口的愈合时间，而且不会发生不良药物反应。另外山奈酚是一种黄酮类化合物，具有抗炎，抗菌、抗氧化、镇痛等多种药理活性[20-21]。Liu等人[22]发现山奈酚可以减少活性氧（ROS）的产生，抑制p38MAPK和JNK的磷酸化降低氧化应激和炎症反应。提示“黄芪-牛膝”治疗糖尿病足是多种化合物通过多种途径发挥作用的结果。

PPI网 络 图 显 示PTGS2、AR、NOS2、ADRB2、ESR1等是治疗糖尿病足的作用靶点。前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2），是非甾体类药物的作用靶点之一，主要参与机体炎症反应[23-24]，并在促进细胞增殖和迁移等方面具有重要作用[25]。雄激素受体（AR）属于核受体超家族中的类固醇受体，在多种组织中均有表达，并且各个组织中表达水平不同，甚至同一组织，也会随其发育阶段而有所变化，病理状态下，表达水平也会发生改变[26-27]。炎症刺激可诱导一氧化氮合酶2（NOS2）的表达并产生大量的NO[28]，NO和过氧亚硝酸盐的增多导致细胞结构的氧化损伤[29]，有研究表明NO在抗氧化中起着至关重要的作用，并有助于应对超氧化物的杀细胞作用[30]。

GO功能富集分析显示“黄芪-牛膝”药对治疗DF的生物学过程主要富集在细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）、小分子代谢过程的调控（regulation of small molecule metabolic process）、抗 氧 化 反 应（response to oxidative stress）、对营养水平的反应（response to nutrient levels）等；细胞组分主要富集在膜筏（membrane raft）、膜微结构域（membrane microdomain）、膜 区（membrane region）、质膜的外侧（external side of plasma membrane）等；分子功能则富集在受体配体活动（receptor ligand activity）、信号受体激活因子活性（signaling receptor activator activity）、RNA聚合酶II-特异性DNA -结合转录因子结合（RNA polymeraseII-specific DNA-binding transcription factor binding）、DNA结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）等。表明“黄芪-牛膝”可以通过参与多种生物学过程发挥其治疗DF的作用。KEGG通路富集分析显示“黄芪-牛膝”治疗糖尿病足通路主要有流体剪切应力和动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis），其次是脂质和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、AGE - RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）和IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）等。相关研究发现AGE-RAGE 信号通路与多种细胞因子，氧化应激及血管等诸多方面有关[31]。HIF-1已被证实在伤口愈合和重塑过程中有着重要作用[32]，HIF-1可以增加细胞增殖、促进血管和胶原的形成等作用促进创面的愈合[33-35]。

文献研究表明成分与蛋白结合自由能低于-5 kcal/mol则可认为二者结合稳定[36]，结合能越小代表成分与靶点蛋白结合越好。而本研究分子对接结果显示结合能均低于-7kcal/mol，说明关键药物成分与核心蛋白有很好的结合作用。其中黄色虚线表示氢键，标明了化合物中该氢键与化合物的位置。

综上所述，本研究利用网络药理学和分子对接技术手段探究了“黄芪-牛膝”治疗DF可能的作用机制，筛选出槲皮素、山奈酚等22个有效活性成分，这些活性成分可能通过PTGS2、AR、NOS2等重要靶点，参与AGE-RAGE、HIF-1等多条信号通路发挥抗炎，抗氧化应激等作用治疗DF，体现了其在治疗时多种有效成分通过多靶点在多通路协同作用的特点，同时利用分子对接技术验证了主要成分与蛋白较高的结合活性，为中医药“黄芪-牛膝”治疗糖尿病足提供了数据支持，为临床应用提供理论基础，为今后深入研究提供参考资料。但本研究仍面临需要克服的困难，如由于现有的相关数据库的尚不完整，有效成分筛选的筛选则不完全，无法揭示其完整的药理作用，同时数据库中的内容常为当前热点问题，使得研究的结果往往集中于热点的靶点和通路，其机制的研究就存在一定的偏颇。而未来对于网络药理学的研究还需要进一步规范数据，运用更多的实验研究加以验证。