清金化痰汤治疗支气管扩张症的作用机制*

巩雪，曲妮妮，李金宗

1 辽宁中医药大学研究生学院 辽宁沈阳 110032 2 辽宁中医药大学附属医院 辽宁沈阳 110032

支气管扩张症为支气管树状分支的不可逆性扩张[1]，是一种致残性疾病，有统计分析其发病率逐年增高，并且可以影响任何年龄段的人。主要症状为咳嗽咯痰，并发持续性咳嗽和劳累性呼吸困难[2]，甚至部分病人只是反复咯血[3]。其疾病名称来源于现代医学研究，但其基础理论可追溯到中国古代中医所谓的“肺痈”“肺胀”等肺系疾病。研究表明，中医药对于支气管扩张症的干预效果显著[4]。随着中医药的日益发展，通过数据网络在系统生物学的理论基础上，分析生物疾病系统和中药有效成分相关靶点，能够更加准确合理地指导中药在临床治疗中的运用[5]。经文献整理研究，清金化痰汤所囊括之药物，由黄芩与山栀子，知母，桑白皮，瓜蒌仁，贝母，麦门冬，橘红，茯苓，桔梗，甘草11味中草药共同配伍而成，临床上常用于治疗呼吸系统疾病中证属痰热蕴肺及相关症状综合征。但中医药向来遵循整体观念和辨证论治这个基本出发点，对方药和疾病的关系研究较少，因而探寻清金化痰汤的与支气管扩张症的关系有重要价值。

资料与方法

1 清金化痰汤有效成分的筛选

于TCMSP数据库[6]，以黄芩、栀子、川贝母、桑白皮、瓜蒌、橘红、桔梗、知母、茯苓、甘草11种中草药为搜索词，通过计算机检索方式得到中草药相关化学成分。因麦冬在TCMSP中搜索不到，故于TCMIP数据库[7]中检索。而后将信息汇总，使用PubChem数据库[8]确认化学成分，获取相对应的2D结构及smiles号。导入SwissADME数据库，选择胃肠道吸收利用度GA值为“高”，并且Lipinski Veber、Ghose、Muegge、Egan 5个选项中2个以上为“是”为活性成分[9]。

2 清金化痰汤靶点预测

将所有活性化学成分2D结构或smiles号导入SwissTargetPrediction数据库，以物种为“homosapiens”，probability＞0.1为筛选条件[10]，预测清金化痰汤活性成分作用靶点。

3 检索已知的支气管扩张症靶点

于GeneCards在线数据平台[11]，以“bronchiectasis”为关键词，筛选与支气管扩张症联系密切的潜在靶点。

4 筛选药物-疾病共同靶点

利用R语言4.1.2获得清金化痰汤与支气管扩张症共同靶点，于Venny 2.1在线平台绘制韦恩图进行可视化。

5 “复方-成分-疾病-靶点”网络图构建及分析

利用Cytoscape 3.8.2，展示“复方-成分-疾病-靶点”网络中共同靶点、关键药物化学成分、疾病之间的相互作用关系。

6 清金化痰汤治疗支气管扩张症的PPI分析

使用String数据库PPI分析功能处理共同靶点，选择物种为“homosapiens”、置信度＞0.4，隐藏离散点，其余设置默认，获得可以展示蛋白相互作用的PPI网络，从而明确清金化痰汤与支气管扩张症共同靶点蛋白间的相互作用。运用Cytoscape 3.8.2对PPI网络进行美化，并且筛选出核心靶点。

7 复方-疾病共同靶点的GO及KEGG富集分析

利用R语言4.1.2及org.Hs.eg.db等相关程序包，对潜在共同靶点的生物过程BP、细胞组分CC、分子功能MF这3个方面分别实现富集分析，选择每项前10绘制可视化柱状图。选择KEGG富集分析前20条进行可视化。从而探究清金化痰汤治疗支气管扩张症的可能潜在作用机制。

8 分子对接

于PubChem数据库[12]下载清金化痰汤核心成分的2D结构，作为配体。于PDB数据库[13]下载核心基因的蛋白结构，作为受体。在Pymol软件对受体蛋白去水、加氢、加电荷。配体及受体均需在AutoDock 1.5.6更改为pdbqt格式。运用Pymol获得对接盒子xyz坐标轴参数，输入AutoDock-Vina开始分子对接，这时计算机CPU运算得出最低结合能。PyMol获得的受体与配体结合的复合物，导入PLIP平台[14]进行分析，使用PyMol对最佳分子对接模式进行可视化。

结果

1 清金化痰汤活性成分及靶点筛选结果

依照上述标准，检索并筛选清金化痰汤的化学成分，并结合已发表的相关文献，去重后共得出清金化痰汤533种活性成分。SwissTargetPrediction数据库提取清金化痰汤533种活性成分的作用靶点，根据Uniport ID删除重复项，最终共得出清金化痰汤活性成分的靶点基因1140个。靶点基因与活性成分一一匹配，剔除49个未匹配成功成分，最终确定该方的活性化学成分为484个。

2 支气管扩张症靶点获取结果

GeneCards数据库中得出与支气管扩张症联系密切的已知潜在靶点1348个。

3 药物与疾病的共同靶点获取

通过R语言得到共同靶点210个，于Venny 2.1在线平台绘制韦恩图。见图1。

图1 药物-疾病共同靶点韦恩图

4 “复方-成分-靶点-疾病”相互作用网络图

将清金化痰汤中533个活性成分与210个共同靶点导入Cytoscape 3.8.2中，隐藏游离节点（删除114个与疾病靶点无交集的活性成分），展示“复方-成分-靶点-疾病”关系网络。见图2。成分度值越大，说明其在治疗支气管扩张症中发挥作用越显著。选取度值前10的成分，作为清金化痰汤治疗支气管扩张症的核心成分。见表1。

图2 “复方-成分-靶点-疾病”相互作用网络

表1 度值排名前10的活性成分

5 清金化痰汤治疗支气管扩张症的PPI网络及核心靶点

依照上述标准，使用String数据库PPI分析功能处理共同靶点，删除1个离散节点，选择tsv格式文件下载，并且导入Cytoscape 3.8.2构建网络图。见图3。网络图含有209个节点和3682条边，运用CytoNCA插件进行拓扑分析（Topological Data Analysis，TDA），根据接近中心性CC、借助度中心性DC、介度中心性BC、局部边连通性LAC和网络中心性NC、特征向量中心性EC这6个指标，以大于中位数为标准，进行3次计算分析，后获得9个核心基因，分别是GAPDH、TNF、IL6、AKT1、VEGFA、IL1B、STAT3、JUN、MAPK3。见图4、图5。

图3 PPI网络图

图4 PPI网络核心基因筛选流程图

图5 核心基因

6 GO靶点通路分析结果

GO富集分析表明清金化痰汤治疗支气管扩张症靶点影响了2535个生物学过程，包含77个细胞组成成分，涉及了167个分子功能。BP主要有细胞间黏附的调控、白细胞-细胞粘附、白细胞与细胞粘附的调节、对细菌源分子的反应、对脂多糖的反应、单个核细胞分化、肽基-酪氨酸磷酸化、对外界刺激反应的正向调节、肽基酪氨酸修饰、T细胞活化等；CC包含膜筏、膜微域、质膜外侧、水泡腔、分泌颗粒管腔、胞质小泡腔、免疫突触、细胞顶端部分、空泡腔、质膜筏等成分；MF主要涉及跨膜受体蛋白激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、非膜跨越蛋白酪氨酸激酶活性、趋化因子结合、丝氨酸肽酶活性、丝氨酸水解酶活性、C-C趋化因子受体活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、C-C趋化因子结合等。见图6。

图6 GO富集分析

7 KEGG富集分析结果

KEGG富集分析得到153条通路，富集比较明显的前20个通路包括：晚期糖基化终产物及其受体AGE-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化、Th17细胞分化、乙肝、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、流体切应力与动脉粥样硬化、恰加斯病、人T细胞白血病病毒1型感染、缺氧诱导因子-1信号通路、前列腺癌、蛋白多糖与癌症、NF-κB信号通路、C型凝集素受体信号通路、趋化因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、PD-L1在肿瘤中的表达及PD-1检查点通路、冠状病毒新冠肺炎、甲型流感、细胞衰老、弓形虫病等。见图7。

图7 KEGG富集分析

8 分子对接分析结果

研究表明，结合能为负数时配体与受体可以自动结合，其结合能越低，对接模式越稳定[15]。见表2。结果可知，山奈酚、槲皮素、7，4'-二羟基普黄酮、芹菜素与5个靶点的结合能均较低，并且可以形成稳定氢键，证明清金化痰汤治疗支气管扩张症效果颇佳。为了结果更加可视化，使用PyMol软件对结合能小于- 9.0 KJ/mol的6种对接模式进行绘图。见图8。

图8 分子对接模式图

讨论

1 药物-疾病关系阐述

本病属于难治性疾病，其主要症状为咳嗽、咯痰。在中医学中，咳喘为肺气气机上逆所致。又因气血相随，气机上逆而血随之升从而可见咯血。贺梦雪等[16]从调畅肺气对支气管扩张症进行论治，宗慧琪等[17]认为可以通过调理肺气之上交气机以达人体升降相因，所以通过梳理肺气可以有效干预治疗本病。吴梦清等[18]认为通过化痰逐瘀法可对本病有良好干预效果。

由于反复性呼吸道感染及气道损伤，杯状细胞、鳞状细胞等上皮细胞组织受损，分泌粘液增多，导致痰液增多，气道平滑肌受损从而扩张，气道扩张导致粘液清除失败，感染风险再度增加。所以，持续性细菌感染、免疫反应失调、纤毛清除障碍和气道阻塞等机制相互作用和自我延续，随着时间的推移导致肺功能一步步受损[3]。

清金化痰汤来源于明朝叶文龄所著《医学统旨》，方中橘红擅梳理肺气，更有显著的止咳化痰效果。茯苓属利水渗湿药，而炎症反应为水液堆积，进而劫炼津液化为痰。气机不利导致气机停滞，阳气熏蒸则阻滞而化热，热之极致便会化火。因而方中配合瓜蒌仁、贝母、桔梗以达到清热涤痰之功，并以黄芩、栀子、桑白皮来泄肺中郁火。正如河间学派理论所言，“气有余便是火”。这种“有余”是相对而言，并非绝对化，阻滞造成局部堆积依旧是相对有余。此为火证、热证，那么火热伤津液，所以配合麦冬知母以达到滋养肺阴的功效。又以甘草调和，以防止更多的副作用产生。金之母土也，土者脾也。甘草甘缓之性调和诸药而控制药效吸收利用，是“气归于精而味归于形”也。全方有清热润肺之功，可针对支气管扩张症的相关症状进行有效干预。

2 药物-疾病交集靶点及潜在作用机制分析

本次研究筛选获得的山奈酚、槲皮素、7，4'-二羟基普黄酮、芹菜素均属于类黄酮化合物，是一种广泛的存在于我们日常的膳食类激素。气道粘膜炎症反应表现为粘膜下腺体增生肥厚，以及粘液分泌过多。山奈酚和槲皮素皆可通过调节NF-κB信号通路，拮抗TNF-α、IL-6等炎症因子的分泌，同时增强抗氧化酶的表达程度，进而拮抗炎症反应[19-21]。Cicek M[22]等通过大鼠实验研究表明，芹菜素可以抑制氧化应激，减少炎性细胞的产生，从而达到改善肺损伤的目的。山奈酚通过阻断支气管上皮内质网应激反应，有效减少粘液分泌，同时抑制杯状细胞增生[23]。来源于甘草的7，4'-二羟基黄酮，可调节NF-κB抑制MUC5AC基因表达[24]，从而减少粘液产生。正如气行则津不停，液不阻则痰不凝，从而可以达到化痰止咳之目的。Treg细胞具有免疫抑制性，可以抑制Th17细胞，拮抗IL-17介导的炎症反应及气道重塑过程。而槲皮素可加强Treg细胞分化、减弱Th17细胞分化，来恢复Th17/Treg的平衡[25]，达到这一治疗作用。7，4'-二羟基黄酮还可抑制嗜酸性粒细胞趋化因子产生[26]，有效降低哮喘支气管扩张表型及支气管肺曲霉病患者患者血清IgE水平，减轻气道炎症。正如《内经》所言，“正气存内，邪不可干”，“邪之所凑，其气必虚”。上述核心成分均可减少粘液分泌，拮抗炎症反应，改善机体免疫力，延缓气道重塑，减轻气道损伤。

本次研究发现9个核心靶点蛋白，分别是GAPDH、TNF、IL6、AKT1、VEGFA、IL1B、STAT3、JUN、MAPK3。GAPDH分布在人体的各个部分，参与糖酵解的能量代谢，还参与了细胞衰老凋亡、DNA修复及自噬、炎症反应条件、免疫调节等生理过程。Takaoka Y等[27-28]研究表明，GAPDH可以显著降低促炎细胞因子和血清趋化因子的表达，且可通过调节NAD1/NADH平衡，影响巨噬细胞吞噬功能和极化，从而改善大鼠肺损伤。Menéndez R等[29]通过对165名患者进行临床研究发现，IL17、TNF、IL-6和IL-8水平越高，患者支气管扩张程度越广泛，气道阻塞越严重。IL-6为炎症反应重要因子，还参与免疫、代谢、再生和神经过程的调节，对因病毒感染和细菌感染引起的炎症反应有重要调节作用[30]。VEGFA是血管内皮生长因子家族的一员，可以促进血管内皮恢复，改善支扩患者的咯血症状。同时VEGFA参与缺氧诱导因子-1信号通路，缺氧或者持续的铜绿假单胞菌感染会诱导VEGFA合成，促进生成小血管，使血管通透性升高并且渗入大量炎症介质与细胞，加重炎症反应[31]。STAT3可以影响Th17信号通路，生成IL-17使中性粒细胞聚集介导炎症反应，还与因气道损伤导致基底细胞向纤毛细胞分化的过程相关，并且参与粘液分 泌[32]。所以清金化痰汤可抑制相关炎症反应，提高机体免疫力，减少咯血，改善肺功能以及呼吸道平滑肌气道损伤，延缓气道重塑过程。

GO与KEGG分析结果显示，靶点基因主要富集在炎症细胞间的黏附、免疫细胞分化与激活、蛋白质特异性结合以及AGE-RAGE信号通路、Th17细胞分化、缺氧诱导因子-1信号通路、NF-κB信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。AGE-RAGE信号通路与炎症反应密不可分，RAGE是一种促炎因子，属于免疫球蛋白超家族，其受体在肺部感染期间上调；AGE和RAGE均可以起肺细胞的氧化应激和凋亡[33]。TNF能够抗感染、拮抗病毒复制及蛋白质合成，还可对抗细胞增殖[34]。在支扩气道炎症进展过程中人体自身免疫功能发挥作用，Th17细胞和CD8+T细胞、TNF-α参与其中，铜绿假单胞杆菌的细菌反应所释放的内毒素因子以及TNF-α因子会刺激树突状细胞，从而能够引起T细胞的细胞分化，这将影响Th17细胞分化通路[35]。NF-kB是重要的二聚体转录因子，参与炎症、免疫调节、细胞粘附、生长信号、细胞增殖分化凋亡，在支气管扩张症发病机制和急慢性炎症反应机制中起到重要作用。可见清金化痰汤可通过控制炎症反应、减少粘液分泌、提高机体免疫力、延缓气道重塑等方面，多成分、多靶点、多通路治疗支气管扩张症。

通过分子对接发现，核心成分山奈酚、槲皮素、7，4'-二羟基普黄酮、芹菜素与核心蛋白GAPDH、TNF、IL6、AKT1、VEGFA的结合能均为负数。说明核心成分可以自动结合核心蛋白，并且发挥作用，通过介导激活或抑制其相关通路，达到对支气管扩张症的干预作用。

综上所述，本研究阐明清金化痰汤中山奈酚在内的多个有效成分可通过介导Th17细胞分化、缺氧诱导因子-1信号通路、NF-κB信号通路、肿瘤坏死因子信号通路在内的多通路干预效应，达到多成分多靶点多通路的有效干预。对临床治疗支气管扩张症的作用机制具有借鉴意义，同时也为更临床应用提供了理论支撑。但由于数据库信息不全面、药材成分差异等问题，结论仍待进一步实验和临床研究验证。