人诱导多能干细胞来源的心肌细胞构建短QT综合征疾病模型概况

2022-11-22张伟黄从新

中国心脏起搏与心电生理杂志 2022年1期

张伟黄从新

人诱导多能干细胞（hiPSCs）已经成为一个具有巨大吸引力的种子细胞，它能克服疾病建模和药物研发中动物模型存在的一些局限性[1]。患者特异性的hiPSCs具有自我更新和多向分化的潜能，能够提供各种疾病相关的成体细胞，这为以前无法获得的细胞类型（如心肌细胞和神经细胞）提供了丰富的来源。短QT 综合征（SQTS）是一种由单基因突变引起的遗传性心律失常，以室性快速心律失常及患者心脏常无结构性改变为特征，可导致晕厥和心源性猝死，是造成年轻人（尤其是婴幼儿）心源性猝死的主要原因之一。SQTS的患病率较低，成人约0.02%～0.1%，儿童约0.05%[2—3]，以男性为主，其特征是校正的QT 间期（QTc）缩短并伴有较高的心脏猝死风险。目前为止，已经报道了与不同基因突变有关的8种类型的SQTS[4]。已有多项研究表明，hiPSCs来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）可以在细胞、组织水平上有效地模拟SQTS，并利用SQTS患者来源的hiPSC-CMs筛选治疗SQTS 的潜在药物。

1 hiPSCs及(hiPSC-CMs)

hiPSCs的出现革新了干细胞领域的研究，这类细胞与胚胎干细胞相似，理论上具有无限增殖和分化为任何特定细胞类型的潜能，但与胚胎干细胞不同的是，hiPSCs是由体细胞（如成纤维细胞、血细胞等）经一系列转录因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC 或OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN18等）重编程产生的[1，5—7]，这避免了医学伦理上的争议；hiPSCs为发病机制和药物筛选的研究提供了患者来源的种子细胞，并为实验性移植治疗提供了丰富的细胞来源，这将极大促进个性化医疗和精准医疗的发展。

经十余年的发展，hiPSCs可通过不同的分化方案向心肌细胞定向分化[8]。患者特异性hiPSC-CMs提供了一个新的以人源性心肌细胞为基础的实验平台，以概括人类心肌细胞生物学的关键特征。研究表明，不同患者来源的hiPSCs具有相同的分子、电生理、代谢特征以及心肌细胞超微结构，但表现出的功能特征更类似于胎儿心肌细胞，尚处于不成熟状态[9]。

hiPSC-CMs表达心肌细胞特异性标志物，具有心肌细胞典型的动作电位特征，并能对儿茶酚胺类和胆碱类药物产生反应；根据心肌细胞亚型的特性标志物及动作电位的形态，可将hiPSCs-CMs分为心室肌样细胞、心房肌样细胞以及窦房结样细胞[10]。由于hiPSC-CMs可来源于患者，因此hiPSC-CMs已成为构建遗传性心脏病（如SQTS）模型的热点种子细胞[11]。目前诱导hiPSCs向hiPSC-CMs分化的不同方案产生心肌细胞的比例存在一定的差异，进而导致心肌细胞亚型的差异，因此在利用hiPSCs-CMs研究心脏疾病时应考虑细胞异质性。

2 细胞水平上构建SQTS模型

2018年El-Battrawy等[12]首次利用hiPSCs建立SQTS细胞模型。该研究小组招募了1例SQTS 1型（SQTS1）患者（基因KCNH2携带N588K 突变）和2例健康者，并将皮肤来源的成纤维细胞重编程为hiPSCs；采用单层细胞培养的方法诱导hiPSCs定向分化为hiPSC-CMs，随后对其进行病理生理及药理学研究。研究发现，与正常对照组来源的hiPSC-CMs相比，SQTS1患者来源的hiPSC-CMs的快速延迟整流钾通道电流（IKr）密度增加，而动作电位时程（APD）缩短，而且表现出异常的钙瞬变和节律性活动。卡巴胆碱能增加SQTS1-hiPSCs-CMs发生心律失常的风险，奎尼丁可以延长APD 和消除卡巴胆碱对SQTS1-hiPSCs-CMs的致心律失常作用。基因及蛋白表达谱分析，SQTS1-hiPSCs-CMs中基因KCNH2和HERG 通道蛋白表达上调。

CRISPR/Cas9基因编辑技术通过插入或修正突变基因可以产生具有相同遗传组成的hiPSCs细胞系，极大地促进了基因疾病的研究[13]。Guo 等[14]将hiPSCs 和CRISPR/Cas9 基因编辑技术有机整合在一起，在细胞水平上研究SQTS患者的病理机制。该团队招募3例志愿者，包括1例SQTS1患者（基因KCNH2携带T618I错义突变）和2例健康成年人；并将这3 例志愿者的皮肤成纤维细胞重编程为hiPSCs，随后利用CRISPR/Cas9技术将SQTS1患者的hiPSCs中KCNH2基因的T618I突变修正，依此作为具有相同遗传背景的对照组（GC-iPSCs）。所有的hiPSCs通过单层细胞培养方案被诱导分化为hiPSC-CMs。采用膜片钳技术进行电生理研究表明，与正常对照组（Con-iPSC-CMs）和GCiPSC-CMs相比，SQTS1-hiPSC-CMs表现为APD 缩短和节律紊乱；而且SQTS1-iPSC-CMs的IKr密度增加，KCNH2的膜蛋白表达也明显增加，这与IKr密度增加的表现是相符的，在单细胞水平再现了SQTS的表型。在药物检测中发现，奎尼丁干预显著延长了SQTS患者（携带KCNH2 基因T618I突变）的QTc间期，降低了T 波波幅。在细胞水平，奎尼丁有效地恢复SQTS-hiPSC-CMs中的APD，突出了患者特异性hiPSC-CMs在体外实验中再现药物治疗效果的能力。此外，该研究团队还发现，Bm KKx2 可通过靶向抑制KCNH2通道进而延长APD，这些结果表明，Bm KKx2等多肽毒素可作为未来发现治疗SQTS药物的先导化合物。这些研究表明，患者特异性和GC-iPSC-CMs能够再现SQTS的单细胞表型。这些发现将有助于阐明SQTS的机制，并发现以肽毒素为先导化合物治疗该疾病的治疗药物。

3 SQTS-hiPSCs-CMs在药物检测中的应用

目前奎尼丁被证明是治疗SQTS1 患者唯一有效的药物，但是临床用药发现，奎尼丁具有较为严重的胃肠道反应。Zhao等[15]利用来自SQTS1患者的hiPSC-CMs检测伊伐布雷定、阿吗灵、美西律、氟卡尼、雷诺嗪、胺碘酮对动作电位（AP）的影响和心律失常事件的发生，以寻找治疗SQTS1患者的潜在有效药物。他们采用膜片钳技术和单细胞收缩测量来评估药物效应。研究发现，伊伐布雷定、美西律、阿吗灵可以延长SQTS1-hiPSCs-CMs的AP，其潜在机制可能是这些药物能够明显抑制KCNH2通道，进而使IKr电流密度降低；此外，伊伐布雷定、美西律、阿吗灵还可减少肾上腺素诱发的心律失常；而氟卡尼、雷诺嗪以及胺碘酮却没有此类作用[15]。但该研究仅使用了1 例SQTS1 患者的hiPSCs-CMs，其显示的药物效应还需在更多不同SQTS1患者来源的hiPSCs-CMs进行验证。

丙吡胺可延长QTc间期，并可通过阻滞钾通道标准化QTc[16]。Lan等[17]首次以SQTS1 患者（HERG 通道携带N588K 突变）的hiPSC-CMs 为模型，探究了丙吡胺延长APD 和抗心律失常作用的离子机制。研究发现，丙吡胺能够延长SQTS1-hiPSCs-CMs的APD 并能减少自发搏动的SQTS1-hiPSCs-CMs经卡巴胆碱和肾上腺素干预后心律失常事件的发生，其可能机制是，丙吡胺通过增强内向L 型钙电流（ICa-L）、晚钠电流、钠钙交换电流（INCX）并抑制外向小电导钙活化钾通道电流（ISK），进而改善SQTS1-hiPSCs-CMs的APD，但丙吡胺对快速和缓慢激活的延迟整流钾通道电流和ATP敏感型钾通道电流无影响。在正常对照组的hiPSC-CMs中，丙吡胺抑制峰钠电流、ICa-L、IKr以及ISK，同时能够增强晚钠电流和INCX。这些结果表明，丙吡胺可有效预防HERG 通道携带N588K 突变的SQTS1患者的快速心律失常。

Huang等[18]使用健康者和SQTS1 患者（携带N588K突变）的hiPSC-CMs检测药物对h ERG 通道门控动力学的影响。研究结果显示，与健康者来源的hiPSC-CMs相比，阿吗灵、胺碘酮、伊伐布雷定、氟卡尼、奎尼丁、美西律和雷诺嗪对来自SQTS1患者来源的hiPSC-CMs的HERG 通道电流（IKr）的抑制程度较低。奎尼丁和美西律能减少SQTS-hiPSC-CMs和健康者hiPSC-CMs的IKr达到峰值的时间，但阿玛林、胺碘酮、伊伐布雷定和雷诺嗪产生了相反的效应。由于激活或失活曲线的移动可能会改变窗口电流，因此评估了同一细胞在无药物和有药物情况下的IKr窗口电流。在SQTS1-hiPSC-CMs中，奎尼丁、伊伐布定、阿吗灵和美西律降低了IKr窗口电流，但胺碘酮、氟卡尼和雷诺嗪未能降低IKr窗口电流。这些研究结果提示，窗口电流减少和失活减缓效应可能是药物在HERG 突变的SQTS1患者发挥抗心律失常作用的主要机制，这些发现可能有助于我们寻找治疗SQTS1患者的潜在候选药物。以上研究提示，SQTS患者来源的hiPSC-CMs可为患者选择有效药物提供良好的体外模拟平台。

4 组织水平上构建SQTS模型

对遗传性心律失常的研究大多集中于hiPSC-CMs的细胞特性，即动作电位特性和离子电流分布。研究更复杂的电生理现象，如传导和折返在心律失常综合征（如SQTS），则需要发展多细胞的组织模型，近年来有学者致力于构建能够更准确概括组织和器官水平疾病病理生理特征的SQTS模型[19]。Shinnawi等[20]首次报道整合患者的hiPSC-CMs、CRISPR/Cas9基因组编辑和组织工程技术作为工具研究SQTS。该团队利用的hiPSCs来源于有3代心脏猝死家族史的SQTS患者，基因检测发现，该患者KCNH2基因编码的HERG 通道存在杂合错义突变（N588K）。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将该患者来源的hiPSCs系中的突变修正，以建立相同遗传背景的对照组，然后在细胞水平上检查hiPSC-CMs的电生理特性。全细胞膜片钳记录显示，与纠正或健康系相比，SQTS-hiPSC-CMs的APD 明显缩短。进一步的研究发现，通道蛋白表达增加和失活减弱导致IKr电流增强，这与其他学者[12，14]的在细胞水平上的研究结果是一致的。作者将hiPSCs-CMs作为大型（5 mm）心肌细胞片植入三维模具结构中；这种简单的类组织结构（SQTS-hiPSCCCSs）使细胞形成功能合胞体，并能均匀增殖。光学标测（optical mapping）显示SQTS-hiPSC-CCSs的APD 明显缩短，但与正常组相比，传导速率无明显改变；SQTS-hiPSCCCSs经程序性电刺激后发生折返性心律失常的敏感性增加，与SQTS患者心室颤动诱发性增加一致；并在该模型上证实奎尼丁和二吡嗪通过延长APD 发挥抗心律失常作用。该项研究表明，使用患者特异性hiPSC-CMs在细胞和组织水平上再现SQTS疾病表型的能力，并为SQTS患者心律失常的起始、持续和治疗提供新的见解，以及为药物研发和测试提供独特的实验平台。