基于DNA标记的食品掺假定量分析研究进展

陈爱亮

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

食品掺假 （Food adulteration）是一种为了追求不正当经济利益而故意实施的用低值伪劣食品或非食品成分冒充高质高值食品的具有潜在健康风险的食品欺诈行为。2013年欧洲发生“马肉风波”事件并蔓延多个国家，在多批次掺假牛肉样品中发现马肉含量在60%～100%[1]，并且这种马肉冒充牛肉的食品掺假事件屡禁不止，2020年全球范围内发生多起马肉冒充牛肉事件。食品掺假问题得到了全球越来越多的关注，已经成为当前食品安全新的热点问题之一。

针对食品掺假行为，近年来发展了一系列的化学、生物以及物理学等技术来对食品的真实性进行鉴别，主要包括DNA分析技术、稳定同位素与元素分析技术、色谱－质谱技术、核磁共振技术以及红外光谱和拉曼光谱技术等。由于食品基本来自于动植物、真菌等生物农产品，因此利用DNA技术分析食品的物种组成，成为食品掺假鉴别中最主要、最准确可靠的方法之一。DNA分析被广泛用于肉及肉类制品、鱼及鱼类产品、果汁饮料、乳品等的掺假鉴别，包括定性分析和定量分析两类，其中目前主流的技术还是定性分析[2]，定量分析技术比较少。而依据食品中掺假成分的含量开展有效监管和合理执法具有重要意义。因此近年来，基于实时荧光定量PCR和数字PCR技术以及高通量测序的DNA定量分析技术在食品掺假分析中越来越受到重视。本文综述了基于DNA分析的食品掺假定量分析技术的研究进展。

一、食品掺假分析定量阈值的设定

用于鉴定食品真伪的基于DNA标记的方法是定性分析的理想方法[2]，例如检测原料或掺假品的种类，回答是或否的问题，即是否存在一种物种与另一种物种的替代。然而，在食品真实性检测中有许多情况需要定量分析。由于基于PCR扩增的DNA分析技术非常灵敏，低于1%甚至0.1%乃至0.01%的物种成分都有可能通过PCR扩增检测出来，因此，经常造成无法区分故意掺假（例如，通过故意用较便宜的替代品代替高质量的肉类材料）和无意偶然污染（例如，由于不同批次加工之间的设备清洗不充分而导致的其他物种的污染或者储运过程中不同类产品造成的沾染）的问题。而通过定量分析区分蓄意掺假和无意污染对于监管执法是至关重要的。

针对上述问题，首先需要根据食品工业具体实际经验制定合适的阈值作为判断蓄意掺假和无意污染的规则，不同产品制定的阈值也不尽相同[3]。例如，2013年马肉风波事件之后，英国食品标准局（UK Food Standards Agency）将未申报成分的上限设定为1%（w/w）[4]，作为后续执法行动的依据。同时如果发现未申报成分的含量超过0.1%（w/w），则要求解释说明。对于欧盟批准的转基因产品，食品和饲料产品中未申报的转基因物质含量低于0.9%（w/w）[4～5]，就被认为是意外污染，不需要进行标签标识。而考虑食品加工链条长，成分复杂，来源多样，尤其是转基因产品越来越多，可能无法完全避免转基因产品的引入，因此日本及部分东南亚国家对转基因标识规定的阈值是5%，韩国是3%，即低于5%或3%可以不用标识[5]。鉴于蓄意的食品掺假是为了追求经济利益，因此一般掺假的比例不会很低，否则很难获得经济利益，基于此，欧盟将未申报物种低于5%（w/w）水平认为是偶然污染[4]，对于进口的印度巴斯马蒂大米，则规定只要其未获批准的品种含量低于7%[6]，即可以免征关税。再比如，意大利面需要由产量相对较低而质量较高的硬粒小麦（Triticum durum）制备而成，有记录表明，将原本用于制作意大利面食的硬粒小麦与普通小麦混种，可以获得经济收益。这种掺假影响了最终面食的烹饪特性以及消费者的适口性，为了防范此类做法，欧盟对意大利面食产品中的非硬粒小麦的含量也作出不得超过3%的阈值规定。

二、基于DNA标记的食品掺假定量分析方法

在制定阈值的基础上，其次即是开发基于DNA分析的食品真实性鉴别定量分析方法。目前主要有3类DNA分析方法用于食品掺假定量分析。

（一）实时荧光定量PCR方法实时荧光定量PCR方法（Quantitative real-time PCR，qPCR）可以通过监测荧光信号强度实时监测PCR产物的积累，并根据荧光扩增曲线的Ct值推测样品中初始DNA含量。加上荧光定量PCR仪器良好的精密度、灵敏度、特异性和通量，使得实时荧光定量PCR很好地成为一种准确的相对定量方法。

使用实时PCR进行定量的一种常见方法是，配制要检测样品的已知系列浓度参考物质，制定Ct值－浓度参考曲线，然后将待测样品测定的Ct值代入标准曲线求得未知样品的含量。这种方法比较适合单一成分的含量分析。而对于食品掺假分析，即可能含有不止一种成分的样品基质来说，更多是采用测定目标物种相对于另一个或多个目标的数量比值。例如，在转基因分析中，转基因成分的数量表示为样品中特定分类单元的转基因材料与非转基因材料的数量比值（例如转基因大豆与非转基因大豆的比值）。同样，对于羊肉掺鸭肉样本的鉴别分析，可以分别测定样本中羊肉和鸭肉的DNA标记的Ct值，并将二者的比值代入利用羊肉－鸭肉标准混合样品所做的标准曲线，求出二者各自的含量。

除了分别测定食品中各个目标物种的DNA拷贝数推算标称物种或者掺假物种的含量之外，也可以通过测定样品中标称物种（或掺假物种）成分基因拷贝数与物种通用（参考）基因拷贝数的比值，来推测原来样品中标称物种或掺假物种的相对百分含量。这种测定相对比值的方法最大的优点是非靶向检测。例如，笔者开发了一种羊肉掺假鉴别的定量检测方法，通过测定羊肉物种特异性基因与动物通用参考基因的比值，即可得出一份肉制品中羊肉的含量[7]。通过羊肉的含量就可以知道羊肉有无掺假，而无需知道样品中到底是掺加了鸭肉、鸡肉还是水貂肉，解决了肉类鉴别中因为不知道掺了什么肉而不知道检什么的“黑匣子”样品肉问题。在该羊肉鉴别中采用的DNA标记是线粒体基因，线粒体DNA在不同组织不同细胞间数量高度变异，因此，为了进一步提高定量方法的准确性，笔者团队对方法进一步改进，选用了细胞核内染色体上的物种特异性单拷贝基因以及通用内参单拷贝基因进行羊肉掺假定量，减少了定量的误差[8～9]。相对于肉类掺假定量鉴别要特别注意避免因为取样不均造成的误差，这种测定比值的方法对液体类等容易混匀的样品鉴别定量更为准确。例如，笔者团队利用这种单拷贝核基因的方法相继建立了骆驼奶、驴奶掺假牛奶的检测方法[10～11]。

在知道掺假物种的情况下，也可以通过检测掺假物种DNA标记拷贝数与通用内参基因拷贝数的比值来计算掺假水平。例如，通过测定马肉物种特异性基因与哺乳动物通用内参基因的拷贝数比值推测掺假牛肉中马肉的含量[12]。当然，这种特异性基因－内参通用基因拷贝数比值的方法适合于能够找到覆盖食品中所有成分的通用基因的样品。如利用哺乳动物通用内参基因进行肉类掺假定量鉴别的前提是标称和可能掺假的物种都是哺乳动物类，如果掺假了大豆蛋白，则该方法就无法准确定量，除非选用一个动植物通用的内参基因并通过配制系列标准样品验证方法的准确性后才能在实际中应用。

虽然荧光定量PCR方法用于食品掺假定量的概念原理非常简单，但将其应用到实践中并达到必要的精确度和准确性往往是一项挑战。这是因为该方法测定的是不同目标成分的DNA标记拷贝数相对值，是一种相对定量的方法，会由于不同目标成分DNA扩增效率的差异而带来定量的误差。

（二）数字PCR方法数字PCR（Digital PCR）技术是一种不需要标准曲线就可以进行核酸分子绝对定量的技术，其相对于实时荧光定量PCR有3个显著的优点。（1）不需要校准曲线来代入测量值计算含量，从而最小化甚至是完全消除标准品和测试样品之间的误差。虽然实时荧光定量PCR过程被认为是指数扩增，但实际中可能并非如此，由于抑制剂的存在，低初始浓度的核酸分子可能无法放大到可检测的水平。同时由于实时荧光定量PCR中DNA定量是相对于校准曲线进行的，因此，当待测样本的PCR扩增效率可能由于基质差异而与参考样本的PCR扩增效率不同时，结果可能会受到影响。而这些现象可以通过应用数字PCR来减少甚至完全克服[13]。（2）数字PCR是基于终点PCR而不是实时PCR的检测方法，而且由于通过微滴化减少了潜在扩增干扰抑制，在PCR扩增效率方面，它们很少导致扩增反应的完全抑制。只要在一个分区中存在一个模板拷贝，就会在反应终点产生一个可检测到的阳性扩增信号。因此可以更精确地测定扩增后是否存在目标及直接计数目标基因拷贝数。而对于实时荧光定量PCR来说，部分抑制会降低扩增效率，从而延迟荧光信号的积累。（3）高水平的样本分割意味着数字PCR可以提供DNA拷贝数的绝对定量结果，即使在非常低的DNA拷贝数情况下也具有较高的准确性[14～15]。通过分割，靶标DNA与非靶标DNA的比值明显高于原始样本，因此数字PCR更适合于在存在高背景竞争非靶标DNA的情况下检测少数靶标。同样高水平的样本分割也相对提高了靶标DNA与共同提取时的抑制物的比值，从而使数字PCR比实时荧光定量PCR抗抑制剂能力更强[16～17]。

目前数字PCR技术已经被用于肉类掺假等各种食品掺假定量分析。由于1个细胞含有多个线粒体且不同细胞线粒体数目不同，从而导致不同细胞线粒体基因拷贝数不同。因此与定性鉴别采用线粒体基因不同，利用数字PCR技术进行食品掺假定量分析，一般选择核染色体单拷贝基因作为靶标，从而避免因为靶基因拷贝数不同带来的误差。例如，中国检验检疫科学研究院陈颖研究员团队[18]以管家基因复制蛋白A1（RPA1）基因为靶标，利用数字PCR技术建立了羊肉中鸡肉掺假的定量分析方法，并且给出了DNA拷贝数与肉质量分数的转换常数，结果表明，该方法比荧光定量PCR测量误差更低。FLOREN等[19]则采用核染色体F2基因作为靶标，建立了基于数字PCR方法的牛肉、马肉以及猪肉制品的掺假鉴别方法。2017年，英国LGC公司组织比较了实时荧光定量PCR、数字PCR以及非同位素标记质谱技术对肉类掺假定量分析的差异。通过对掺假含量在0.1%至10%之间（w/w）系列肉类掺假标准样品的测定，得出结论认为，数字PCR具有更高的精确度和准确度，尤其是对于痕量目标的检测更为准确。

虽然数字PCR技术愈来愈受到重视并获得更多应用，但是当前数字PCR仪器成本以及每次的样本分析测试成本仍然相对较高，在很多分析实验室没有普及。而且需要注意的是，很多情况下并不能简单地将荧光定量PCR的条件转换为数字PCR的条件，还需要进一步针对数字PCR进行优化。除此以外，数字PCR因为样本分割的原因，动态范围比荧光定量PCR小，更适合低目标浓度的样品分析。相对而言，基于比值的荧光定量PCR方法虽然误差相对较大，但由于经济利益驱动的食品掺假一般都会在5%甚至30%以上，荧光定量PCR方法也基本可以满足食品掺假定量分析的需求，鉴于其快速、便携、低成本的优势，未来在食品掺假定性定量鉴别中会获得很好的应用。

（三）高通量测序技术这里所说的高通量测序技术与DNA宏条形码测序技术是一样的，除了利用宏条形码高通量测序技术对混合样本中的物种进行鉴定外，利用高通量测序技术也可以对混合样本中各物种的含量进行测定，其依据是各物种目标序列测序丰度与物种的含量正相关[20]。但是实际上用高通量测序对食品不同成分进行定量还有很大的挑战，测序丰度与物种含量的相关性受到多个因素的影响，其中最主要的就是由于通用引物错配、PCR条件等引起PCR扩增效率的偏差，使得不同物种扩增效率不同，最终影响到定量的准确性[21]。当然采用免扩增直接测序的方法可以去掉扩增效率偏差的问题，但如果采取目标捕获测序法进行定量，又受限于无法确定不同物种间条形码拷贝数、读长等信息，从而仍然无法准确定量。如果采取全基因组测序法，虽然可以提高定量的准确性，但在检测成本和数据处理方法方面会受到很大挑战。

三、DNA含量与食品质量比的转换关系

其实不管哪种基于DNA分析的食品掺假定量分析方法，都是基于DNA的含量来反推样品的重量或者质量的。然而要将基于数字PCR测定的DNA拷贝数或实时荧光定量PCR测定的DNA的Ct值比值结果，直接转换为按成分计算的每种成分的重量或质量比值是不容易的。在表示两个测量维度的结果时，需要使用一个转换因子，而这个转换因子的值可能受到多种因素的影响，包括不同物种相对基因组大小以及植物物种的倍性水平等。例如，继2013年欧洲的马肉事件之后，英国环境、食品和农村事务部（DEFRA）委托英国政府化学家实验室开发了一种用于马DNA定量的实时PCR方法。通过测定样品中马DNA相对于哺乳动物DNA总量的数量来判断马肉的含量。该方法利用马肉（肌肉）和牛肉（肌肉）样品进行验证，结果表明，该方法适合于牛肉中掺有低水平的马肉以及1%的阈值测定，因此可以用于后期的执法行动。这是因为马的基因组估计比牛肉的基因组小9%左右。当将测定的DNA拷贝数比值转换为重量比值时，9%的基因组误差对低水平的马肉掺假影响有限。但如果马肉掺假率更高，比如含有50%（w/w）马肉的牛肉样本，其测定的DNA拷贝数比值可能是55份马基因组对50份牛基因组。因此设计计算从DNA到食品质量的转换因子或者校正因子，必须考虑到马和牛肉基因组的相对大小以及样本中这两个基因组的相对丰度，从而实现两种测量维度之间准确的转换。

除了DNA拷贝数与食品质量之间的转换因子需要考虑之外，有关DNA自身的因素在定量的时候也需要加以考虑。首先，不同组织部位的DNA拷贝数与组织的质量的比例并不相同，比如肌肉组织、肝脏组织甚至含脂肪较多的其他组织等，在比较时应尽可能保持标准品与待测样品组织类型一致。其次，在整个分析过程中，DNA提取过程也必须可重复，并且混合样品中不同物种成分DNA的提取效率相同。最后，对于加工制品，也需要对不同物种DNA/组织质量的比值影响一致，才能尽量给出准确的定量分析结果[22]。

四、发展趋势与展望

毫无疑问，目前对于食品掺假分析来说，精准定量还是最有挑战的，无论是已知掺假成分下的实时荧光定量PCR或者数字PCR技术，还是存在未知成分下的高通量测序技术，都受到3个方面的影响，一是待测样品与参考物质之间以及同一样品内不同物种之间DNA提取以及扩增效率不同导致的误差；二是所选的DNA标记在不同物种或者同一物种不同组织部位之间拷贝数不同带来的误差；三是最重要的，即不同样品之间存在较大的组成差异，DNA拷贝数－肉或者其他食品质量的转换因子并不是一个恒定的值，尤其是对于含有未知掺假样品的食品，这些因素影响更大。

虽然可以通过优化选择合适的DNA标记、使用标准的参考物质、采用数字PCR或者免扩增的高通量测序技术来减少定量误差，但误差总是不可避免的。食品基质的复杂性，比如肉的异质性也决定了食品掺假定量分析不可能做到十分精准。因此从某种程度上来讲，就像根据经验制定一个合适阈值区分掺假和沾染一样，可以根据不同的食品掺假种类，制定相应合适的误差接受范围，作为依据来选择合适的技术对可能掺假的样品进行定量。其实从追求经济利益的角度讲，掺假比例一般不会低于10%甚至50%乃至更高或全部掺假，而高比例的掺假，误差一般比较低，只有在很低的水平比如10%以下误差才会较高。从这个角度考虑，对于复杂的食品基质掺假定量分析，比如肉制品、奶制品掺假等，参考食品安全兽药残留免疫试剂盒备案批内批间差的要求，根据不同的食品欺诈类型，制定一个10%～30%误差范围，可能有助于推动食品掺假定量分析方法在食品欺诈监管执法中的应用。同时为了更科学合理地对食品掺假进行监管执法，未来也需要对不同的食品掺假种类设定合理的掺假判定阈值，以便区分故意掺假和无意沾染。制定合理的阈值可以从两个方面进行考虑。一是经济利益驱动的食品掺假，一般掺假比例不会很低，从这个角度去考虑，可以设定一个掺假判定阈值的高值，比如1%～10%。二是根据具体食品的种类及其生产、加工、储运、销售等全过程中可能发生的无意沾染情况来设定一个掺假判定阈值的低值，比如0.1%～1%。

总之，在合理掺假判定阈值设定的基础上，根据食品掺假类型，分别选择实时荧光定量PCR、数字PCR和高通量测序等技术可以实现对食品掺假现象主要是物种种属掺假现象的初步鉴别。当然，食品种类繁多，组成复杂，食品掺假的类型也复杂多样，更多的时候可能需要一种或多种技术联用，才能达到更为准确的食品掺假定量鉴别分析。