肠道黏蛋白MUC12与仔猪断奶腹泻的关系研究

2022-11-21张思琦谢雨萌刘欣欣

黑龙江动物繁殖 2022年5期

孙超，丛赫，张思琦，谢雨萌，刘欣欣，李柯

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

断奶仔猪由于消化系统还没有发育完善，消化酶、胃液分泌较少，免疫和体温调节等生理功能不健全，断奶后易产生三方面的应激：即营养、心理、环境［1］。其中营养应激影响最大，容易发生仔猪断奶应激综合征，主要有食欲障碍、消化不良、发育迟滞、饲料效率低下、反应迟钝、抗病能力弱、水肿和腹泻等表现，其中腹泻已成为断奶仔猪最普遍且影响较大的应激性疾病，造成体重下降、存活率降低［2］，直接影响猪场的经济效益。仔猪断奶是其生长发育过程中的一个必经阶段，而断奶应激性腹泻一直是养猪生产的难题。

断奶应激能引起肠道形态、结构的破坏和肠道菌群失调，导致杯状细胞数量、机能受到影响，从而加重仔猪腹泻。肠道作为动物体内最主要的消化吸收器官，对动物体影响较大，肠道上皮细胞主要分为杯状细胞（gobletcell，GC）、内分泌细胞、吸收细胞和潘氏细胞4种，其中杯状细胞能分泌黏蛋白和一些生物活性因子，与水结合形成黏液，可以抵御肠黏膜内外源侵害，与上皮细胞紧密连接，与肠道微生物共同作用维持肠道内环境稳态［3］。黏蛋白是杯状细胞主要的分泌产物，其核心蛋白总称为MUC，由黏蛋白基因转录翻译而来，在GC的内质网和高尔基体内进行聚合、修饰、糖基化和折叠，再分泌到细胞外，与肠腔内一些物质及水混合形成黏液凝胶［4］，这是宿主抵御肠道内容物（如微生物和食物残渣）的第一道防线［5］。迄今共发现21种黏蛋白基因，根据其结构和定位分为分泌型和膜结合型两类，杯状细胞主要分泌形成黏液凝胶的分泌型黏蛋白，由5种寡聚体黏蛋白（MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC19）及1种非寡聚体黏蛋白（MUC7）组成，膜结合型蛋白主要包括MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC12、MUC13、MUC16、MUC17、MUC20［3］。膜结合型蛋白主要依靠跨膜区与肠上皮细胞膜结合，参与细胞信号转导、黏附、生长及相关免疫调节功能。民猪作为我国优良的地方猪种之一，具有肉质好和抗病力强等特性，具有极大的研究价值。民猪的肠道黏液屏障及其免疫功能是否优于外来猪种、与仔猪断奶后的腹泻易感性有无关系，是值得深入研究的科学问题。本试验对仔猪各肠段杯状细胞进行着色度统计，采用qRT-PCR方法测定MUC12 mRNA相对表达量，以探究肠道黏蛋白MUC12与断奶腹泻的关系，现报道如下。

1 材料

1.1 试验动物

本试验未进行预试验，以黑龙江省兰西县种猪场自繁的民猪仔猪和长白猪仔猪为研究对象，随机选取35日龄断奶民猪48头、长白猪60头，且所选仔猪均在断奶前无腹泻现象发生。民猪、长白猪仔猪均选取2／3进行断奶处理。参照舒邓群等［6］的腹泻评分方法，根据跟踪观察仔猪断奶后3 d内腹泻情况划分为断奶腹泻组与断奶健康组，断奶健康组仔猪粪便外观呈条形或粒状；断奶腹泻组选择中度腹泻仔猪，粪便外观为稠状、不成形、粪水无分离。并在两组仔猪38日龄分别随机选取6头仔猪屠宰（民猪、长白猪各3头）。民猪、长白猪仔猪1／3为未断奶组（对照组），也在38日龄屠宰（民猪、长白猪各3头）。共计屠宰18头仔猪。

1.2 主要试剂

反转录试剂盒（RR047A），购自宝日医生物技术有限公司；TRIzol Reagent，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；荧光染料试剂盒（型号为46660900），购自罗氏生物科技有限公司；PAS染液（型号为G1008）和石蜡，购自武汉塞维尔生物科技有限公司；DL 2 000 Plus DNA（型号为ZM405）Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司；DEPC水（型号为R0021），购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 主要仪器

电泳仪（型号为DYY-Ⅲ-8B）、水平电泳槽（型号为DYY-Ⅲ33A），购自北京市六一仪器厂；PCR仪（型号为TGRADIENT），购自德国Biometra公司；微量移液器，购自德国Eppendorf公司；实时荧光定量PCR仪（型号为AB17500），购自美国Applied-Biosystems公司；紫外分光光度计（型号为Ultrospec1000），购自美国Phamacia公司；NikonDSRi1显微镜，购自日本尼康公司。

2 方法

2.1 饲喂与断奶

民猪和长白母猪分娩后与所产仔猪在同一圈舍饲养，并用不同圈栏将母猪及同栏仔猪隔开。仔猪35日龄时，随机将部分哺乳母猪赶走，仔猪仍留在原圈栏，开始饲喂教槽料进行断奶处理；而圈栏里未赶走的母猪继续哺乳仔猪。待仔猪生长至38日龄时处理全部仔猪。

2.2 样品的采集

两品种仔猪均在38日龄的上午09：00耳部静脉注射药物氯丙嗪镇静，并颈静脉放血处死。采集仔猪十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠中段各组织样约0.5 g，使用生理盐水漂洗，除去血液和粪便，放入DEPC溶液处理过的EP管中，-80℃保存，备用；另取仔猪十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠中段各组织样约1.5 g，在10%中性福尔马林中保存，用于石蜡切片的制作。

2.3 肠道杯状细胞着色度的统计

采集屠宰后仔猪十二指肠、空肠、回肠和结肠组织，由石蜡包埋后切片，经高碘酸-Schiff氏剂（PAS）染色，通过NikonDS-Ri1显微镜（100×）观察肠道杯状细胞形态。参照参考文献［7］的方法进行杯状细胞着色度的统计，每头仔猪各肠段取3张切片，每张切片随机选择6个不同视野，用Image J软件进行杯状细胞着色度的数据采集。

2.4 RNA质量判断

采集断奶健康组、断奶腹泻组、未断奶组仔猪的肠道组织样，提取各肠道组织总RNA，跑胶验证提取的总RNA质量。

2.5 RT-PCR

使用β-actin基因引物对反转录产物进行普通PCR扩增，采用1%琼脂糖凝胶进行电泳试验。

2.6 实时荧光定量PCR

仔猪肠道组织样用于提取总RNA，利用反转录试剂盒反转录成cDNA，将其用作模板进行荧光定量PCR试验，采用相对定量法测定基因表达水平，所用的引物（见表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成。扩增体系（10μL反应混合体系）：SYBR Green Master 5μL，上下游引物各0.4μL，ddH2O 3.2μL、cDNA模板1μL。反应条件：50℃2 min，95℃10 min；95℃15 s，退火1 min，共40个循环，每个样品设置3个重复。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

2.7 数据的统计分析

采用Excel软件对数据进行初步处理和计算；用SPSS 25软件进行方差分析；均数间用邓肯氏法进行多重比较，分析不同品种、不同组别仔猪肠道杯状细胞着色度和MUC12 mRNA相对表达量的差异；数据结果以“平均值±标准差”表示；用GraphPad Prism 8.0软件绘制图表。

3 结果与分析

3.1 肠道杯状细胞的着色度统计

仔猪肠道杯状细胞测定结果见图1、图2。由图1可以看出，经过PAS染色的肠道杯状细胞在显微镜下轮廓清晰。

图1 长白猪和民猪肠道杯状细胞Fig.1 Intestinal goblet cells of Landrace and Min pigs

由图2可以看出：（1）长白猪十二指肠杯状细胞着色度断奶健康组和断奶腹泻组显著（P＜0.05）高于未断奶组，而在空肠、回肠和结肠中长白猪断奶健康组着色度降低，且在空肠和回肠中均显著（P＜0.05）、极显著（P＜0.01）低于未断奶组。民猪断奶健康组在十二指肠、回肠和结肠中着色度也低于未断奶组，其中在回肠中民猪断奶健康组显著（P＜0.05）低于未断奶组。（2）品种间比较，民猪未断奶组着色度在十二指肠、空肠均极显著（P＜0.01）高于长白猪，结肠中略高于长白猪。民猪断奶健康组十二指肠、空肠、回肠和结肠中着色度均显著（P＜0.05）、极显著（P＜0.01）高于长白猪。民猪断奶腹泻组在回肠中着色度显著（P＜0.05）高于长白猪，其余肠段均低于长白猪。说明断奶后民猪肠道仍含有更多的黏蛋白，以减轻断奶应激对肠黏膜的损伤，这可能是断奶民猪腹泻程度较低的原因之一。

图2 肠道杯状细胞着色度统计Fig.2 Colorimetric statistics of intestinal goblet cells

3.2 RNA质量判断

采集断奶健康组、断奶腹泻组、未断奶组仔猪的肠道组织样，提取各肠道组织总RNA，跑胶验证提取的总RNA质量。通过1%琼脂糖凝胶做电泳检测，结果见图3。由图3可以看出，样品均呈现28 S、18 S、5 S 3个条带，其OD260／OD280值为1.8～2.0。说明所用RNA的完整性和纯度全部满足反转录的要求。

图3 RNA的电泳检测结果Fig.3 The result of RNA electrophor

3.3 RT-PCR

使用β-actin基因引物对反转录产物进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测的结果见图4。由图4可以看出，扩增产物与所设计的目的片段长度保持一致，证明反转录产物可以用于后续试验。

图4 β-actin的PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification products ofβ-actin gene

3.4 实时荧光定量PCR

由于SYBR GreenⅠ荧光染料法定量PCR具有与双链DNA非特异性结合的特殊性质，为确认检测反应的特异性，需要进行熔解曲线分析，结果见图5。由图5可以看出，β-actin、MUC12基因的熔解曲线具有重复性好、单一峰值的特点，说明引物具有特异性。

图5 β-actin MUC12的扩增熔解曲线Fig 5 Amplification and melting curves ofβ-actin MUC12

3.5 肠道MUC12mRNA相对表达量

民猪、长白猪仔猪肠道MUC12mRNA相对表达量见图6。由图6可以看出：MUC12mRNA相对表达量在民猪、长白猪十二指肠、空肠和回肠中很低，而在盲肠和结肠中明显较高。十二指肠中，长白猪和民猪断奶健康组和断奶腹泻组MUC12 mRNA相对表达量没有明显差异；长白猪各组MUC12 mRNA相对表达量均高于民猪，且长白猪未断奶组显著高于民猪未断奶组（P＜0.05）。但在空肠和回肠中，两品种的各组间均无显著差异。与未断奶组比较，长白猪断奶健康组和断奶腹泻组盲肠MUC12 mRNA相对表达量均降低，而民猪断奶健康和断奶腹泻组极显著（P＜0.01）升高，同时民猪断奶健康组和断奶腹泻组盲肠MUC12 mRNA相对表达量极显著（P＜0.01）高于长白猪断奶健康组和断奶腹泻组；结肠中，与未断奶组相比，长白猪和民猪断奶健康和断奶腹泻组MUC12 mRNA相对表达量均有所降低；品种间比较，民猪未断奶组结肠中MUC12 mRNA表达量极显著（P＜0.01）高于长白猪。

图6 肠道MUC12mRNA相对表达量Fig.6 Relative expression of intestinal MUC12mRNA

4 讨论

腹泻发生与肠道黏膜屏障完整性密切相关，黏蛋白是肠道黏液屏障的重要组成部分，在肠道黏膜保护和修复中发挥着不可缺少的作用，它们可以在肠道上皮表面形成保护层，保护肠道上皮完整并使其润滑，帮助细胞黏附，阻止病原体、毒素和异物的侵害［8］。分泌型黏蛋白是由杯状细胞产生的，杯状细胞与免疫系统密切相关，黏蛋白和杯状细胞的发育在生命早期受到严格的调控，并与微生物定植同步，发育中的黏蛋白和杯状细胞的失调与感染和炎症条件有关［9］。在正常生理状态下，黏液屏障内黏蛋白含量相对稳定，但如果消化道出现炎症症状，会使黏蛋白的产生和分布受到一定程度的干扰。在炎症的初期阶段，杯状细胞受到炎症刺激，黏蛋白分泌急剧增多，这将导致杯状细胞消耗大量能量，凋亡数量显著增加，引起机体内杯状细胞数量下降，黏蛋白含量降低，肠道黏膜屏障受到损伤，致病菌和炎性因子更容易入侵机体，导致肠道抵抗力减弱，病情加重或继发其他肠道疾病［10］。有研究表明，患有炎症性肠病（inflammatory boweldisease，IBD）的机体中杯状细胞的分化及黏蛋白的表达、成熟及分泌均受影响［11-12］。在大多数肠道感染中，急性期发生杯状细胞诱导黏液蛋白的合成和分泌，杯状细胞的快速大量分泌不仅有利于病原体的排出，还能维持黏液保护层的完整性［13］。本试验结果表明：肠道杯状细胞着色度比较，民猪未断奶组十二指肠、空肠、结肠均高于长白猪，说明民猪在未断奶时肠道就含有较高的黏蛋白含量，这可能对民猪肠道抵御断奶应激有一定的防御作用；在断奶后，民猪断奶健康组十二指肠、空肠、回肠杯状细胞着色度都高于长白猪，说明民猪在断奶后黏蛋白含量仍高于长白猪，能够更好地保护肠道黏膜，减轻断奶应激对仔猪肠道黏膜的损害，这可能是民猪断奶后受到的应激程度、腹泻率低于长白猪的重要生理基础。

在黏液分泌细胞及其细胞系中，通过对早期小鼠模型的研究［14-15］，发现膜结合型黏液蛋白和杯状细胞分泌的分泌型黏液蛋白之间似乎存在表达协调和功能协调，这两组分子都有助于上皮内稳态［16］。与分泌型黏蛋白不同，膜型黏蛋白是由机体中许多类型的非特化上皮细胞表达的，而MUC12作为跨膜型黏蛋白，特征是一个N端胞外结构域、一个或多个黏蛋白结构域、一个跨膜结构域和一个C端细胞质尾，其磷酸化位点参与细胞内信号转导传递［17］，在上皮细胞生长方面发挥功能，进一步促进肠道的生长发育、维护肠道的完整性；同时，MUC12在＞50%的原发性和转移性结肠、直肠肿瘤中高度表达，也在结肠和小肠的正常上皮细胞表达；溃疡性结肠炎会导致机体内杯状细胞数量减少、体积缩小，从而影响黏蛋白分泌量减少，可见杯状细胞和MUC12与肠道疾病密切相关［8，18］。肠道黏膜组织作为病原微生物侵染猪体的主要渠道，黏蛋白MUC12是肠道黏膜屏障中的重要成分，屏障损伤会导致猪出现肠道疾病，因此保持屏障的完整性对猪的肠道健康起着关键作用［19］。本试验中，MUC12 mRNA相对表达量在不同肠段组织有明显差异，在十二指肠、空肠、回肠中几乎不表达，在结肠和盲肠中表达量则比较高。相关研究发现，形成肠黏液的黏蛋白在小肠和大肠中具有不同的性质，小肠的孔隙很大，允许细菌和细菌化颗粒穿透黏液，小肠黏液的这种穿透性可能是致病菌主要通过其他方式感染肠道这一区域的主要原因，小肠黏液只有一层，通常很容易被吸入且不附着［19］；在结肠中有两层黏液系统，其中外层黏液毛孔扩张，使细菌得以渗透，而内层黏液分层并组织成一个过滤器，内层黏液的孔隙足够小，可以阻止直径小于0.5 mm的细菌或小珠的渗透［20］。黏蛋白在不同肠段性质的差异可能是影响MUC12 mRNA相对表达量在不同肠段组织差异明显的重要因素。结肠中，各组民猪MUC12mRNA相对表达量均高于长白猪，且未断奶组MUC12mRNA相对表达量高于断奶健康组和断奶腹泻组。分析原因可能与盲肠和结肠中存在的大量微生物和内毒素，以及来自过敏性的食物源和外源因子有关，通过MUC12的较高表达可以与病原菌和内毒素等物质有效结合，降低外源因素对肠上皮的损伤和破坏，进而增强肠道的保护功能。