沃金黑牛AIDA基因第10外显子多态性检测及关联分析

肖 成，刘 宇，吴 健，2，赵玉民，2，曹 阳*

（1.吉林省农业科学院，吉林 公主岭 136100；2.农业农村部肉牛遗传育种重点实验室，长春 130000）

随着人们生活质量的不断提高，对高品质牛肉的需求越来越大。拥有大理石花纹的牛肉不仅风味好、口感佳，营养价值也更为丰富，同时花纹的多少也直接影响消费者的购买决策。高品质牛肉拥有更广阔的市场，同时也具有更高的销售价格。沃金黑牛是吉林省皓月集团为了满足市场需求而培育的肉牛品种，是以黑毛牛为父本、延边牛为母本，采用“级进杂交＋精准选择”的方法繁育而成，是具有自主知识产权的牛品种［1］。通过多年培育及对黑牛群体生产数据精确的测量和记录发现，沃金黑牛具有产肉率高、抗逆性强、肉质好等特点，但与日本和牛相比生长及肉质性状仍存在一定差距。为了不断选育更优秀个体、提高群体肉质性状，科研人员致力于采用分子育种与常规育种相结合的方法提高选育强度。影响家畜生长率及肉品质的因素很多，其中遗传因素是影响生长以及肉质性状的重要因素之一。有研究表明，IGF-1、GH等基因调控生长激素，影响家畜的生长性状，同时PPAR、LPL等基因调控脂肪沉积量，对肉的嫩度、风味等有明显影响［2-5］。通过分子标记技术及育种技术筛选优秀个体、提高生长速度、增加肌内脂肪含量，是提高我国自主培养品种经济性状的主要研究方向。

研究表明，Axin相互作用蛋白（Axin interactor dorsalization associated，AIDA）基因可以通过内质网相关途径来降解脂肪合成代谢酶，从而导致动物体内脂肪合成减少、降低脂肪在小肠内的吸收率［6］。通过酵母双杂交试验发现，sAIDA基因在动物体内具有重要的生理功能［7］。另有研究表明，AIDA基因能够参与Wnt／βcatenin信号通路，从而影响三酰甘油的合成，降低脂肪细胞中脂滴的积累［8-10］。目前关于AIDA基因在小鼠及家畜脂代谢调节作用的研究较多，但基因本身序列是否存在与家畜经济性状相关的突变位点仍然未知。因此，本试验旨在探索AIDA基因可能存在的SNP位点，并与实际生产数据进行关联分析，以期为提高沃金黑牛经济性状提供新的分子标记位点，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物及数据和样品的采集

12月龄沃金黑牛62头，其中公牛35头、母牛27头，来自吉林省长春市皓月集团。采用软米尺对黑牛体高、十字部高、体斜长、胸围、腹围、管围进行测量；采用B超仪对眼肌面积及背膘厚进行测量，同时尾部静脉采血，用于提取血液基因组。

1.2 主要试剂

血液基因组提取试剂盒，购自Axygen生物公司；PCR反应预混液，购自康为世纪生物公司；一代测序及引物合成，由金唯智生物有限公司提供。

1.3 基因组提取及验证

血液保存于含抗凝剂的采血管中，取250μL血液用血液基因组提取试剂盒提取DNA，方法参照试剂盒说明书。所得DNA经过琼脂糖凝胶电泳试验，检测片段的完整性。完整性好的基因组通过超微量分光光度计测量其浓度以及纯度，OD260／OD280值在1.8～2.1之间表示纯度较好。将纯度高、完整度好的DNA放置于-20℃保存，用于后续试验。

1.4 引物设计及PCR验证

以NCBI网站提供的牛AIDA基因组NM-001205634.1为参考，利用Primer Premier 5.0软件设计第10外显子引物，引物信息见表1。从62头沃金黑牛基因组中随机选择10头牛的血液基因组进行混池，并以其为模板对设计的引物进行特异性验证。PCR反应体系：2×Taq Master Mix 10μL，ddH2O 8μL，上下游引物各0.5μL，混池DNA 1μL，共20μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56.5℃退火30s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸8 min，产物于12℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，条带单一代表其特异性良好。

表1 AIDA基因第10外显子引物序列Tab.1 Prim er sequence of exon 10 of AIDA gene

1.5 Sanger测序、SNP统计及关联分析

对特异性好的引物进行混池PCR反应，产物特异性好的直接进行Sanger测序。查看测序结果，寻找可能存在的SNP位点，然后对每头牛的基因组进行PCR试验及测序，检测此突变位点在62头牛中的基因型分布情况。统计突变位点每头牛的基因型，计算基因频率、基因型频率、杂合度、PIC含量及氨基酸变化情况等。由于公母牛的生产数据存在差异，为了避免数据差异对关联分析造成干扰，公牛、母牛分别统计生产数据，与不同基因型进行的关联分析。

1.6 数据的统计分析

沃金黑牛生产数据通过SPSS 17.0进行统计，以“平均值±标准差”表示。不同基因型与实际生产数据关联分析，采用单因素方差分析及LSD法进行多重比较，P＜0.05差异显著。

2 结果与分析

2.1 AIDA基因引物特异性验证

通过PCR试验和琼脂糖凝胶电泳方法检测，发现AIDA基因第10外显子片段的引物特异性良好，可用于下一步试验。AIDA基因第10外显子PCR产物电泳图谱见图1，条带为980 bp，与目的片段大小符合。

图1 AIDA基因第10外显子PCR产物电泳图谱Fig.1 Electrophoretic pattern of PCR products in exon 10 of AIDA gene

2.2 AIDA基因第10外显子多态位点分析

通过对沃金黑牛基因组PCR以及Sanger测序发现，在AIDA基因第10外显子89 bp处，也就是Chr16：26159088存在A／C突变，见图2。此突变位点存在3种基因型，分别是CC、CA、AA型，CA为主要基因型，A为主效基因，见图3。突变位点为中度多态，符合哈代-温格伯定理。具体数据见表2。AIDA基因的第10外显子的突变位点为错义突变，赖氨酸突变成谷氨酰胺。

图2 沃金黑牛AIDA基因测序序列对比Fig.2 Comparison of AIDA gene sequencing sequence ofWojin Black cattle

图3 沃金黑牛AIDA基因不同基因型峰图Fig.3 Peaks of different genotypes of AIDA gene in Wojin Black cattle

表2 AIDA基因第10外显子多态位点（Chr16：26159088位点）相关信息Tab.2 Related information of polymorphic locus（Chr16：26159088 locus）in exon 10 of AIDA gene

2.3 AIDA基因第10外显子与生产数据关联分析

由于公母牛在生产数据上存在差异，试验将62头沃金黑牛的生产数据进行了按性别分别统计，与AIDA基因型进行关联分析，避免公牛、母牛生产数据的差距导致分析错误，结果见表3。通过单因素方差分析发现，在公牛组中基因型CC背膘厚显著高于CA基因型（P＜0.05），而在母牛组中不同基因型在本次测量的生产数据中未出现显著差异（P＞0.05）。

表3 AIDA基因第10外显子不同基因型与生产数据关联分析Tab.3 Correlation analysis between different genotypes of exon 10 of AIDA gene and production data

3 讨论

本研究还对黑牛不同阶段的生长数据进行了测量。通过与其他牛品种的生产数据相比发现，沃金黑牛生长及肉质性状高于同月龄草原红牛，但低于日本和牛［11-14］。因此，沃金黑牛仍需要不断提高选育强度以提高经济性状。影响家畜肉质性状的因素很多，如营养水平、饲喂条件、品种类型等，但具体原因是由于肌纤维组成种类、肌内脂肪含量、氨基酸组成、脂肪酸组成等因素影响肉质的口感、风味、营养价值等［15］。通常衡量家畜肉质性状都需要测定背膘厚、肌内脂肪含量、眼肌面积等，这表明动物本身的脂肪合成代谢及在肌肉内的积累对于肉质改善具有重要作用。动物出生前，脂肪细胞的数量就已经确定，因此参与脂肪细胞分化及代谢的基因决定了家畜后天脂肪积累的能力［16］。例如Wnt／β-catenin信号通路决定了间充质干细胞分化方向，同时也可以诱导脂肪前体细胞分化成成熟脂肪细胞［17］。C／EBPα、FABP4也促进了脂肪细胞分化并且与动物肉质性状相关［18-19］。而目前针对AIDA基因的研究也多数集中在调控脂肪代谢方面，同时有大量研究表明，AIDA基因是调控脂代谢的重要成员之一，与Wnt／β-catenin通路及脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C／EBPα、FABP4等基因相关［20］。本研究在前人的基础上寻找可能与牛肉质性状相关的位点，结果发现AIDA基因在第10外显子处存在一个突变位点，该位点与公牛背膘厚显著相关。通常背膘厚较大的个体在适当饲喂条件下脂肪囤积的能力更强，肉质可能更好；AIDA基因此处突变导致赖氨酸突变为谷氨酰胺。赖氨酸为极性带正电荷的碱性氨基酸，而谷氨酰胺为极性不带电荷的亲水性氨基酸，这样剧烈的变化将会影响其蛋白构象、空间结构，导致其蛋白质表达水平或作用发生改变，从而导致表型可能出现不同。这方面内容值得深入研究。本试验群体中，基因型CC沃金黑牛个体不多，但该突变位点符合哈代-温伯格定律，表明试验结果可信。在12月龄母牛群体中只检测到CC基因型1个个体，无法进行数据关联分析，但可以确定公母牛背膘厚这项数据之间不具有显著差异（P＞0.05）。由此看来，随着测量数据的不断扩增，对其调控机制的深入探索，AIDA基因可能成为调控肉质性状重要的候选基因。

4 结论

本试验结果表明：AIDA基因Chr16：26159088处存在A／C突变，有AA、CA和CC三种突变型，且均为错义突变；氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酰胺；该位点处于哈代-温伯格平衡状态（P＞0.05）；关联分析发现该位点多态性与雄性沃金黑牛牛背膘厚呈显著相关（P＜0.05），基因型CC个体的背膘厚高于其他基因型。