癌组织M6A甲基转移酶样蛋白3水平对手术切除后接受索拉非尼治疗的肝细胞癌患者预后的影响*

高正兴，李广欣，宋春青

肝细胞癌(HCC)为肝脏最常见的原发性恶性肿瘤。欧洲肝脏病研究学会认为，目前肝癌已成为全球男性第五大常见的恶性肿瘤之一，在女性则排名第八位，占全球癌症总数的5.4%左右，每年约造成69.5万人死亡[1]。术后给予索拉非尼治疗HCC患者能有效抑制血管内皮生长因子受体和血小板衍生性生长因子受体，阻断肿瘤新生血管的生成，抑制肿瘤细胞生长[2，3]。有关基因的水平及其功能发挥在肿瘤发生、发展、转移过程中扮演重要角色。同时，它们也是早期诊断、靶向治疗、预后评估肿瘤患者的研究热点[4]。己发现上百种RNA修饰方式，其中N6-甲基嘌呤(M6A)是出现在腺嘌呤第六位N原子上的甲基化修饰方式，也是最常见的基因转录后RNA修饰方式，约占RNA甲基化修饰的80%[5]。甲基转移酶样蛋白3(METTL3)为甲基转移酶复合物主要的催化成分，一方面其是催化细胞RNA M6A修饰形成的主要酶，经M6A修饰途径调节基因水平；另一方面，METTL3具备促进mRNA翻译的能力[6，7]。肺癌[8]、白血病[9]、前列腺癌[10]等肿瘤组织METTL3呈现异常高水平，可能发挥了促癌基因的作用。本研究检测了HCC组织METTL3水平，并分析了其对索拉非尼治疗效果的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2016年8月～2019年8月我院诊治的HCC患者62例，男43例，女19例；年龄为41～78岁，平均年龄为(60.9±10.1)岁。诊断符合《原发性肝癌诊疗规范(2011年版)》[11]的标准，其中乙型肝炎55例，丙型肝炎2例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ期28例；Child-Pugh分级：A级33例，B级29例；肝外转移：无46例，有16例。纳入患者预计生存期≥12周。排除标准：合并其他恶性肿瘤、合并血液系统疾病、合并人类免疫缺陷病毒感染、存在恶液质或多器官功能衰竭。患者及其家属签署知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会审核、通过。

1.2 治疗方法 肝切除术：所有患者均接受术中超声检查，划定手术切除范围，尽可能保留足够的剩余肝脏。对于合并门静脉癌栓者，在切除肿瘤的同时依据癌栓位置进行门静脉切开取栓或门静脉残端取栓；对于合并胆管癌栓者，行肿瘤切除和胆总管切开取栓术；对于存在淋巴结转移者行淋巴结清扫。术后，给予索拉非尼400 mg口服，2次/d，连续服药。在服药期间，根据患者出现的不良反应情况，及时调整药物剂量。对于出现Ⅱ级以下不良反应者，给予对症治疗；对于出现Ⅱ级以上不良反应者，减低药物剂量为400 mg，1次/d；对于出现Ⅲ级或以上不良反应时，予以停药，待毒性反应缓解或降至Ⅱ级以下后，再逐步恢复至原剂量。

1.3 组织METTL3 mRNA水平检测 采用qRT-PCR法，用Trozol试剂提取癌组织和癌周组织总RNA。采用 Prime ScriptTMRT 反转录试剂盒(日本宝日医生物科技公司)将总RNA反转录为cDNA，使用 SYBR. Premix Ex Taq qRT-PCR试剂盒(北京全式金生物科技公司)扩增cDNA，应用2-△△CT法计算METTL3 mRNA相对水平。METTL3 上游引物为 5′-CCCTATGGGACCCTGACAG-3′，下游引物为5′- CTGGTTGAAGCCTTGGGGAT-3′，内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶 ( GAPDH) ，其上游引物为5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下 游 引 物 为 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.4 随访 采用门诊复查或电话随访，随访时间为2年。调查并记录患者生存情况。

2 结果

2.1 癌组织与癌旁组织METTL3 mRNA水平比较 62例癌组织METTL3 mRNA水平为(7.7±1.4)，显著高于癌旁组织(5.3±1.1，P<0.05)。

2.2 不同临床和病理学特征患者癌组织METTL3 mRNA水平比较 在肿瘤直径≥5 cm、TNM分期Ⅲ期和肝外转移患者癌组织METTL3 mRNA水平显著高于肿瘤直径<5 cm、TNM分期Ⅰ/Ⅱ期和无肝外转移患者(P<0.05，表1)。

表1 不同临床和病理学特征患者癌组织METTL3 mRNA水平比较

2.3 肝细胞癌患者癌组织METTL3水平对患者预后的预测价值 在随访2年末，肝细胞癌患者生存27例，死亡35例；生存组癌组织METTL3水平为(7.0±1.0)，显著低于死亡组[(8.2±1.1)，P<0.05]；应用METTL3水平预测患者预后的最佳截断点为7.6，ROC曲线下面积(AUC)为0.712[95%CI：0.584～00.839]，其灵敏度、特异度和准确度分别为71.4%、66.7%和69.4%(图1)。

图1 应用癌组织METTL3 mRNA水平预测肝细胞癌患者预后的效能

2.4 癌组织METTL3高水平与低水平肝细胞癌患者Kaplan-Meier生存分析 随访2年，绘制2 a总体生存曲线，按照癌组织METTL3 mRNA水平评估最佳截断点，结果将METTL3 mRNA水平<7.6者纳入低水平组(n=28)，≥7.6者纳入高水平组(n=34)。随访结果显示，METTL3 mRNA低水平组2 a总体生存率为64.3%，显著高于高水平组的26.5%(P<0.05)。

3 讨论

肝细胞癌病死率居我国恶性肿瘤的前列，严重威胁人类生命健康。虽然现阶段肝癌的检测、诊断、治疗水平不断提高，但其治疗效果仍不理想[12]。近年来研究结果表明[13]，肿瘤分子靶向治疗具有良好的安全性和一定的有效性，尤其是针对多靶点Raf激酶抑制剂、表皮生长因子受体和血管内皮生长因子为靶点的药物。索拉非尼作为一种小分子激酶抑制剂能有效阻断肿瘤新生血管的生成，抑制肿瘤细胞增殖。

M6A为真核mRNA最常见的修饰方式，由甲基转移酶复合体(METTL3、METTL14、WTAP)组成。去甲基转移酶(FTO、ALKBH5)与结合蛋白(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2)协同调控其表达[14]。METTL3作为甲基转移酶复合体成员之一，具有独立的或与其它甲基转移酶共同催化RNA的M6A修饰形成，发挥其生理功能。既往研究显示[15]METTL3调控的肿瘤基因血管内皮生长因子和B淋巴细胞瘤-2也是与前列腺癌关系密切的癌基因，由此推测METTL3通过调控前列腺癌肿瘤基因影响前列腺癌细胞的生物学行为。METTL3在胶质母细胞瘤、乳腺癌的研究中也显示METTL3表现出促癌作用[16]。在另一项研究中[17]，METTL3被认为是肾癌的抑癌基因，抑制肿瘤增殖、迁移。这些结果表明，METTL3可能在不同分化肿瘤中具有截然相反的作用，可能是由于肿瘤微环境的复杂性、肿瘤高度异质性所致，同时也与METLL3 参与肿瘤的作用密不可分。本研究分析了肝细胞癌组织METLL3水平，分析了其与肝细胞癌发生发展的关系。

本研究显示肝细胞癌癌组织METTL3 mRNA水平显著高于癌旁组织，上调的METTL3可使肿瘤相关癌基因蛋白mRNA m6A修饰丰度增加，从而使其蛋白水平增加，促进肝癌细胞的增殖，在肿瘤发生过程中发挥促癌基因作用。沉默METTL3可有效抑制肝癌细胞增殖、侵袭、克隆能力，增加肿瘤细胞凋亡。进一步分析METTL3 mRNA水平与肝细胞癌临床和病理学特征的关系，结果显示METTL3 mRNA水平与肿瘤直径、TNM分期和肝外转移均有一定的关系。METTL3 mRNA水平随着肿瘤直径增大、分期增高和肝外转移呈升高态势，提示METTL3参与肝细胞癌的进展。METTL3 参与调控mRNA m6A甲基化修饰，这种化学修饰是可逆的，在真核生物体内广泛存在。由于该位点甲基化状态呈实时动态变化，导致mRNA 生成、降解改变，进而影响相关基因的翻译水平，一些重要促癌基因的翻译也受影响[18]。近期也有一些研究发现[19]，METTL3同样能够以一种不依赖甲基转移酶催化活性及m6A阅读蛋白方式对调控促癌基因翻译，受此方式调控的重要促癌基因包括表皮生长因子受体等。无论METTL3促进促癌基因翻译是通过何种机制达到目的，其效果均是一样的，即出现肿瘤细胞过度增殖，凋亡减少，这些变化不利于患者预后，导致肿瘤直径快速增大，远处转移的风险增大。

临床观察到，一部分肝细胞癌患者应用索拉非尼治疗后可有效抑制肿瘤进展，延长生存期，改善生活质量；也有部分患者治疗效果不理想，甚至基本无效[20]。由于索拉菲尼价格昂贵，如何有效筛选合适的患者使其获益增大是临床工作者面临的重大课题。为探讨METTL3水平对索拉非尼治疗的肝细胞癌患者预后的评估价值，本研究采用ROC曲线评估了癌组织METTL3水平的预测价值，发现有一定的临床意义。进一步分析发现，癌组织METTL3高水平组与低水平组患者生存率存在显著性差异，提示低水平组在索拉非尼治疗后预后稍好。

综上所述，肝细胞癌患者癌组织METTL3 mRNA呈现高水平，且其高水平状态与肿瘤直径、TNM分期和肝外转移有关，预示患者预后不良。监测癌组织METTL3水平是否可作为术后接受索拉非尼治疗的肝细胞癌患者的预后指标，值得进一步研究。