血清miR-223-3p和miR-17-5p水平与前列腺癌患者术后复发转移的关系及其预测价值分析*

孙江江，刘 博，周少英△，李 敏

邯郸市中心医院：1.泌尿外科；2.检验科，河北邯郸 056000

前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，近年来我国男性前列腺癌发病率呈升高趋势，有报道显示，2019年我国前列腺癌发病率仅次于肺癌，位居男性恶性肿瘤的第二位[1]。目前，临床上对于前列腺癌患者主张早期行前列腺癌根治术治疗。有研究显示，采用同一手术方案治疗的不同患者预后并不完全相同[2]，提示除手术方案外，前列腺癌患者的预后还与多种因素有关。肿瘤复发和转移是造成患者死亡的主要原因，研究前列腺癌患者术后复发转移有效预测指标具有重要的临床意义。微小RNA(miRNA)是一类具有调控基因表达功能的内源性小RNA分子，参与机体多种生理、病理过程[3]。已有研究表明，miR-223-3p和miR-17-5p均是能够调节细胞增殖的miRNA，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[4-5]。有报道显示，miR-223可以促进胃癌细胞的转移[6]，miR-17-5p可以促进结直肠癌细胞的增殖和转移[7]，但两者是否与前列腺癌患者术后复发转移有关仍未完全明确。故本研究对本院收治的前列腺癌患者血清miR-223-3p和miR-17-5p水平进行了分析，旨在为前列腺癌患者术后复发转移的预测提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年1月至2017年6月本院收治并行前列腺癌根治术治疗的120例患者作为研究对象，另选择同期30例体检健康志愿者作为对照组。术前采集患者临床资料，包括年龄、体质量指数(BMI)、吸烟史、糖尿病史、高血压病史、前列腺癌家族史、收缩压、舒张压、前列腺体积、临床分期。纳入标准：(1)所有患者诊断均符合前列腺癌诊断标准，并经穿刺活检及术后病理诊断证实为前列腺癌[8]；(2)患者初次患病就诊，临床资料完整；(3)患者具有前列腺癌根治性手术治疗指征，未接受放疗、化疗及免疫治疗；(4)患者及家属对本研究知情同意。排除标准：(1)合并严重心、肺、肾功能障碍者；(2)术前合并其他恶性肿瘤者；(3)疾病严重，预计术后生存期小于12个月者；(4)生活不能自理，不能完成本研究者；(5)失访患者。根据纳入、排除标准，最终纳入的116例行前列腺癌根治术患者作为观察组，年龄41～78岁，平均(62.14±8.86)岁；BMI 19～27 kg/m2，平均(23.01±2.43)kg/m2；有吸烟史42例，糖尿病史26例，冠心病史16例，高血压病史33例，前列腺癌家族史6例；术前收缩压115～145 mm Hg，平均(127.85±15.82)mm Hg；术前舒张压72～95 mm Hg，平均(78.01±10.12)mm Hg；术前前列腺体积65～80 cm3，平均(71.05±15.56)cm3；临床分期Ⅰ期35例，Ⅱ期49例，Ⅲ期32例；Gleason评分：≤7分79例，>7分37例。对照组年龄40～80岁，平均(61.07±8.12)岁；BMI 20～28 kg/m2，平均(22.89±2.11)kg/m2。观察组与对照组年龄、BMI差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会同意。

1.2方法

1.2.1治疗方法 所有患者在全身麻醉下行腹腔镜前列腺癌根治术。患者仰卧位，脐下切口建立人工气腹，气腹压力维持在12～15 mm Hg，经脐下将Trocar置入腹腔镜，在脐下腹直肌两侧第一Trocar放置5 mm和12 mm Trocar，髂前上棘内侧放置5 mm Trocar，置入腔镜，并进行操作，分离髂血管及神经，清扫脂肪组织及淋巴结组织。切断耻骨前列腺韧带，离断阴茎背深静脉丛，切开尿道前后壁，并游离精囊，切断两侧输精管，切开尿道的前、后、侧壁，进行前列腺癌根治术，重建膀胱颈，吻合尿道，缝合切口。术后常规留置导尿，抗感染及补液治疗。术后根据不同形态结构的前列腺癌成分占比多少，将前列腺癌分成主要分级区和次要分级区，各区评分范围为1～5分(分越低，分化越好，恶性程度则越低，反之亦然)，将主要分级区和次要分级区评分相加，即为前列腺癌的Gleason评分，范围为2～10分。

1.2.2血清的采集及保存 采集患者术前和健康体检者体检当日清晨空腹外周静脉血10 mL，血液标本室温下静置10 min，以离心半径6 cm、转速3 500 r/min离心10 min，分离血清，将血清置于-80 ℃冰箱保存待检。

1.2.3血清miR-223-3p和miR-17-5p水平检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测血清miR-223-3p和miR-17-5p水平。应用Trizol(美国Invitrogen生产，批号：20151123)提取血清总RNA，采用美国哈希DR3800分光光度计测量260 nm处的吸光度值在1.8～2.0，表明样本有效。应用Taq Man RT kit(日本Takara生产，批号：160216)进行反转录，提取总cDNA，应用TaqMan MicroRNA assay(广州锐博生物公司生产，批号160118)进行扩增反应，以U6为内参，引物序列(表1)由苏州吉玛有限公司合成。反应体系：cDNA 1.33 μL，TaqMan MicroRNA assay 1.00 μL，Taq Man 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μL，ddH2O 7.67 μL，共计20 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，60 ℃延伸60 s，共计45个循环，并重复3次，完成后通过2-ΔΔCt法计算miR-223-3p和miR-17-5p相对表达水平。

表1 miR-223-3p、miR-17-5p及内参U6的引物序列

1.2.4血清前列腺特异抗原(PSA)及睾酮检测 采用酶联免疫吸附试验及配套试剂盒(购自上海恒远生物科技有限公司)检测患者血清PSA水平，计算血清游离前列腺特异抗原/总前列腺特异抗原(fPSA/tPSA)；采用罗氏Cobase 601电化学发光分析仪及配套试剂盒(购自广州兆康生物科技有限公司)检测血清睾酮水平。均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5随访 所有患者通过门诊或电话随访3年，随访截止时间为2020年6月，随访期间每3个月通过电话或患者到门诊进行复查，如患者出现以下情况则认定为复发转移：患者血清PSA持续上升或PSA水平连续两次≥0.2 ng/mL；直肠指检发现异常硬结；骨扫描CT发现转移病灶；经直肠超声检查或活检证实转移[9]。随访3年，4例患者失访，予以剔除，剩余116例患者中，其中37例发生复发转移的患者作为复发转移组，79例未发生复发转移的患者作为未复发转移组。

2 结 果

2.1观察组与对照组血清miR-223-3p、miR-17-5p水平比较 观察组血清miR-223-3p、miR-17-5p水平分别为2.664±0.706、3.145±0.923，对照组血清miR-223-3p、miR-17-5p水平分别为0.829±0.128、1.203±0.221，观察组血清miR-223-3p、miR-17-5p水平明显高于对照组(t=14.141、11.412，P<0.05)。

2.2临床资料在复发转移组与未复发转移组间的比较 复发转移组与未复发转移组年龄、BMI，吸烟史、糖尿病史、高血压病史、前列腺癌家族史患者比例，以及收缩压、舒张压、前列腺体积比较，差异无统计学意义(P>0.05)。复发转移组临床分期为Ⅲ期、Gleason评分>7分、血清PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA≤0.1、睾酮≤3.0 ng/mL的患者比例明显高于未复发转移组(P<0.05)，见表2。

表2 临床资料在复发转移组与未复发转移组间的比较或n(%)]

2.3复发转移组与未复发转移组血清miR-223-3p、miR-17-5p水平比较 复发转移组血清miR-223-3p、miR-17-5p水平均明显高于未复发转移组(P<0.05)，见表3。

表3 复发转移组患者与未复发转移组血清miR-223-3p、miR-17-5p水平比较

2.4前列腺癌患者术后复发转移的影响因素分析 以前列腺癌患者术后复发转移情况为因变量(复发转移赋值1，未复发转移赋值0)，以表2、3中差异有统计学意义的指标为自变量，建立Cox风险比例回归模型。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。分析结果显示，临床分期Ⅲ期、Gleason评分>7分、PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA比值≤0.1、睾酮≤3.0 ng/mL、miR-223-3p>3.192、miR-17-5p>3.556是前列腺癌患者术后复发转移的危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 前列腺癌患者术后复发转移影响因素的Cox风险比例回归模型分析

2.5miR-223-3p、miR-17-5p及血清PSA单独和联合检测对前列腺癌患者术后复发转移的预测价值 以复发转移组为阳性样本，未复发转移组组为阴性样本，绘制ROC曲线，分析结果显示，血清miR-223-3p、miR-17-5p、PSA单独检测预测前列腺癌患者术后复发转移的曲线下面积(AUC)为0.783(95%CI：0.585～0.975)、0.742(95%CI：0.503～0.977)、0.722(95%CI：0.479～0.964)；3项指标联合检测预测前列腺癌患者术后复发转移的AUC为0.859(95%CI：0.755～0.957)，准确度为0.853(99/116)，均明显高于3指标单独检测。见表5、图1。

表5 血清miR-223-3p、miR-17-5p、PSA单独和联合检测对前列腺癌患者术后复发转移的预测价值

图1 血清miR-223-3p、miR-17-5p、PSA单独和联合检测预测前列腺癌患者术后复发转移的ROC曲线

3 讨 论

前列腺癌发生、发展是一个多因素、多基因参与的复杂过程，患者术后复发转移是造成患者死亡的重要原因之一[10]。miRNA是一类长度在18～25个核苷酸的内源性非编码小RNA分子，可与靶基因mRNA 3′端非编码序列结合，发挥转录后调控的作用[11]。研究表明，在机体内miRNA可以调控多种细胞内信号转导通路，参与细胞增殖、凋亡、分化和迁移等过程，尤其是在恶性肿瘤发生、发展及复发转移中，miRNA发挥重要的作用[12-13]。

miR-223-3是miR-223家族的重要成员，由一个独立的启动子转录。有报道显示，miR-223-3主要在循环系统及肌细胞中高度表达，具有抑制成肌细胞增殖及促进成肌细胞分化的作用[14-15]。近年来有学者发现，miR-223-3可以调节肿瘤微环境及癌基因、抑癌基因的表达水平，进而调节肿瘤的发生、发展[16]。目前研究表明，miR-223-3在调节肿瘤发生、发展中具有促癌和抑癌两种作用[17-18]。YUAN等[19]报道，在淋巴瘤细胞系中转染miR-223-3，淋巴瘤细胞的生长速度、集落形成、迁移和侵袭性降低。戚欣等[20]发现，在肝癌SMMC-7721细胞中，miR-223-3水平升高，并通过靶向RAC1促进肝癌细胞增殖，抑制肝癌细胞凋亡，从而促进肝癌的发生。miR-17-5p是miR-17-92簇中最重要的成员之一，是细胞增殖、自噬和凋亡等基本过程的重要调节因子[21]。目前研究发现，miR-17-5p在乳腺癌[22]、结直肠癌[23]、肺癌[24]和卵巢癌[25]中呈高表达，其水平与肿瘤的侵袭性和对化疗药物治疗的反应性有关。本研究发现，观察组术前血清miR-223-3p、miR-17-5p水平明显高于对照组(P<0.05)，且复发转移组血清miR-223-3p、miR-17-5p水平也明显高于未复发转移组(P<0.05)，表明miR-223-3p、miR-17-5p可能促进前列腺癌的发生、发展，与前列腺癌术后复发转移及预后有关。推测其可能原因：PI3K/AKT信号通路是肿瘤发生发展的重要信号通路，在前列腺癌中存在PI3K/AKT信号通路的异常激活，并影响基质金属蛋白酶的表达，后者起到降解细胞外基质，促进前列腺癌表皮细胞向间质细胞转化的作用；另外，PI3K/AKT信号通路还可以促进肌动蛋白的细丝重构，提高肿瘤细胞的运动能力[26]。郭金兰等[27]报道，miR-17-5p可以靶向PI3K/AKT信号通路，调控皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡。ZHU等[28]报道，在胰腺癌中，下调microRNA-223水平可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活，从而抑制胰腺癌的发生。因此，本研究推测，miR-223-3p、miR-17-5p可能激活PI3K/AKT信号通路，升高基质金属蛋白酶的水平，从而增加细胞外基质的降解，促进前列腺癌表皮细胞向间质细胞转化及肌动蛋白的细丝重构，进而促进前列腺癌的复发转移。

本研究结果显示，复发转移组临床分期为Ⅲ期、Gleason评分>7分、血清PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA≤0.1、睾酮≤3.0 ng/mL的患者比例明显高于未复发转移组(P<0.05)。临床分期为Ⅲ期的患者肿瘤进展快，治疗难度大，术后发生复发转移的风险也较高[23]。Gleason评分是目前临床上广泛采用的前列腺癌组织分级方法，与前列腺癌的生物行为和预后具有很高的关联性，Gleason评分>7分为高危前列腺癌，患者术后发生复发转移的风险也较高[29]。PSA是一种含有237个氨基酸的多肽分子，正常情况下由前列腺产生，仅少量存在，具有分解精液中的主要胶状蛋白的作用[30]。当发生前列腺疾病时，血清PSA水平会升高，其表达具有组织特异性[31]。fPSA/tPSA、睾酮也是目前临床上诊断前列腺癌的重要指标，本研究结果表明上述指标与前列腺癌复发转移及患者预后有关。

miR-223-3p、miR-17-5p水平升高可能通过调节肿瘤微环境及癌基因水平来提高前列腺癌的侵袭和转移能力[32-33]，而PSA是评价前列腺疾病的重要血清学标志物，提示miR-223-3p、miR-17-5p与血清PSA在评价前列腺癌上可能有很好的一致性。本研究结果还显示，临床分期为Ⅲ期、Gleason评分>7分、血清PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA≤0.1、睾酮≤3.0 ng/mL、miR-223-3p>3.192、miR-17-5p>3.556是前列腺癌患者术后复发转移的危险因素。因此，对于存在以上因素的前列腺癌患者应予以警惕，并有针对性的采取多学科协同治疗，以改善患者预后。ROC曲线分析结果显示，miR-223-3p、miR-17-5p、PSA单独检测预测前列腺癌术后复发转移均有较高的灵敏度、特异度，但值得注意的是在前列腺炎、良性前列腺疾病中也可能出现PSA水平升高，临床上应注意鉴别[34]，故常采用3项指标联合检测，以改善对前列腺癌术后复发转移预测的准确性。

综上所述，血清miR-223-3p、miR-17-5p水平与前列腺癌患者术后复发转移有关，二者对前列腺癌术后复发转移的预测具有较高价值。临床分期、Gleason评分和血清PSA、miR-223-3p、miR-17-5p水平升高，以及fPSA/tPSA、睾酮水平降低是前列腺癌患者术后复发转移的危险因素，对存在这些危险因素的患者，应早期给予综合治疗，以改善患者预后。