环状RNA 与心血管疾病的研究进展

任捷 陆皆权 叶奔放 熊玮

近年来人类生命健康状况已经得到了极大地改善，但相关流行病学调查显示，心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的患病率和致死率与日俱增，危害着人类健康[1]。众多研究表明除了环境因素，表观遗传学因素和遗传因素也影响着CVD 的发生过程。因此用于早期诊断和靶向治疗的生物标志物的发现对CVD 的诊治意义重大。目前临床已有大量用于CVD 筛查、危险分层、诊断及评价其预后的生物标志物，例如：脑钠肽或N 末端脑钠肽前体、心肌肌钙蛋白等，但仍受病情、年龄、遗传、生活水平和社会因素等诸多方面的限制。根据最新研究报道，环状RNA（circular RNA，circRNA）是非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）家族中的新成员，在多种疾病的病理生理过程中可作为重要的新型调节剂[2]。现有的相关实验已经证明，circRNA 与肺部纤维化、阿尔兹海默病、风湿免疫性疾病及恶性肿瘤等多种疾病具有相关性，因此，近年来CVD 的研究方向也聚焦在circRNA。本文将对circRNA 的生物学特征、病理生理机制及功能作用作一综述，并以此为基础总结目前在CVD 中针对circRNA 的临床及基础研究成果。

1 circRNA 概述

1.1 circRNA 的研究历程 1976 年，Sanger 等[3]发现了构成一种类病毒的RNA，是单链共价闭合结构，从而最先提出了circRNA 的概念。在此之后，2006 年Suzuki 等[4]发现了在果蝇体中的位置环状转录本，但circRNA 在既往的研究中表达水平较低，研究人员忽视了其重要性，甚至认为是一种剪接过程中的不正确表达。随着表观遗传学的快速发展，2012 年Salzman 等[5]通过报道80 余个circ-RNA 使其成为科研界的研究热点，同时证明circ-RNA 影响了多种基因的转化过程，随后Jeck 等[6]也报道了人成纤维细胞中circRNA 达到25 000种，Memczak 等[7]也在小鼠脑组织中鉴别出了超过1 900 种circRNA。

1.2 circRNA 的生物特性 circRNA 是一类特殊的、不同于传统线性结构的ncRNA，大多通过前体RNA 外显子环化剪切形成的新型RNA，即外显子来源circRNA[8]；另外也有少部分来源于内含子，是由信使RNA（messenger RNA，mRNA）前体释放而来，一个由7-nt GU 富含区域及11-nt C 富含区域所构成的模序结构在其合成过程中起重要作用。还有部分circRNA 既来源于内含子，又来源于外显子[9]。根据基因组中所处位点的不同，circRNA可归纳为五大类[10]：（1）基因组circRNA，最常见的有丁肝病毒；（2）内含子circRNA；（3）RNA 加工程序中的circRNA 中间体分子；（4）具备管家基因功能的circRNA，例如核糖核酸酶P；（5）外显子circRNA。

目前已知circRNA 主要通过3 种模式合成[11]，分别是“套索驱动环化”模型、“内含子配对驱动环化”模型以及“RNA 结合蛋白驱动的环化”模型。circRNA 与mRNA 不同，其封闭的结构中即不包含5'端帽子，也不包含3'末端多聚腺苷酸尾，其环状结构是由5'端与3'端通过共价键完成连接，其结构的特殊性决定了RNA 酶/核酸外切酶降解难度较大，因此对比线性结构半衰期更长、遗传更稳定[12]。circRNA 存在于人体的细胞内、外液中，且表达水平远高于线状RNA[6]，同时circRNA 表达具有特定的时空和组织特异性，进化过程也体现了较高的保守性[13]。综上所述，这些生物特性提示circRNA 将在疾病诊断中具备成为更为理想生物标志物的潜能。

1.3 circRNA 的生物学功能

1.3.1 微小RNA（micro RNA，miRNA）的分子海绵miRNA 作为非编码的小RNA 家族中的成员，在复制、翻译及转录的过程中通过碱基互补配对相应的靶mRNA 影响其过程，亦或是降解相应的靶基因，因此，被视为转录后的关键调控子。竞争内源性RNA（competing endogenous，ceRNA）是可以与miRNA 应答元件发生相互作用的所有类型的RNA 分子[14]。circRNA 在真核细胞中的数目更是远远超过了ceRNA，并含有较多的相关应答元件，从而与特定miRNA 的区域结合，仿佛“海绵”紧密吸附于这些特定miRNA，通过该“分子海绵”作用对相关基因进行调控。

Hansen 等[15]发现了微小RNA-7 相关的环状RNA海绵（circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7），其可作为“分子海绵”下调miR-7 的活性。此外，ciRS-7与miR-7 有超过70 个结合位点，ciRS-7 作为miR-7 的抑制剂，ciRS-7/miR-7 可以上调靶基因胰岛素样生长因子1 受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1 R）、表皮生长因子受体的表达，这些被调控的基因及表达分子均被认为与CVD 高度相关[16]。

1.3.2 基因的转录调节 目前所了解的关于circRNA 调控转录的机制主要有：（1）circRNA 可与聚合酶Ⅱ（polymerase Ⅱ，Pol Ⅱ）的延伸复合物反应，通过该反应调控基因的转录[17]；（2）对环状RNA 分子构造的相关分析也发现存在环化外显子内仍留有内含子，即外显子- 内含子环状核糖核酸（exonin-troncircRNA，EIciRNA），其与宿主基因启动子区域的小核核糖核蛋白U1（U1 Small Nuclear Ribonucleoprotein，U1snRNP）相互结合后再结合Pol Ⅱ，最终组成ElciRNA-U1snRNP-Pol Ⅱ复合体，该复合体可以调控相应基因的转录[18]。Zhang 等[19]发现锚蛋白重复结构域52（ankyrin repeat domain 52，ankrd52）中来源的circRNA 通过与其母基因ankrd52 转录过程中相对应的RNA polⅡ特异性结合形成新的复合体，可以通过该复合体调节相关转录效率。同时也发现特异性敲除该circRNA 可以降低ankrd52 的转录效率。

1.3.3 蛋白质的编码调控 由于circRNA 在构造上是不具备典型的5'帽子及3'多聚腺苷酸尾，特殊环形构造造成了其常规的翻译过程是无法进行的。但是内部核糖体进入位点被引入序列中后，即使没有5'帽子结构的环形结构也可以满足蛋白质翻译过程起始的条件，因此，可以得知环形结构也可进行翻译过程合成蛋白质[20]。例如：丁型肝炎病毒中就存在着单股共价闭合结构的circRNA，其病毒蛋白致病性相关核心抗原蛋白的合成与circRNA 被翻译合成密切相关，虽然原理尚不清楚，但circRNA 足以被证实能够进行蛋白质编码[21]。另外，当miRNA 与mRNA 结合时可使蛋白质生成受阻，而当circRNA 发挥“分子海绵”的作用吸附于miRNA 后，miRNA 对mRNA 的翻译过程不会受到抑制，因此，circRNA 能间接影响mRNA 进而调节蛋白质的生成。

1.3.4 生物标志物作用 生物标志物在CVD 的筛查、危险分层、诊断及预后中发挥着重要作用。circRNA 有巨大潜力成为新型CVD 相关的生物标志物。第一，circRNA 因具有高度稳定性，特殊的环状构造使其面临相关核糖核酸外切酶降解时具备较强的抵抗能力，从而半衰期延长，其中部分半衰期可超过48 h，因此高度稳定的circRNA 是值得期待的标志物[22]；第二，Li 等[23]证明大量的circRNA 遍及细胞的内外液中，且大量循环在血液中，便于识别和提取；第三，在心血管疾病中circRNA 更是大量表达并调节其过程，可作为靶向治疗的靶点。

2 circRNA 与CVD

2.1 circRNA 与冠状动脉粥样硬化 当冠状动脉壁内皮下层脂质发生沉积时，就进而会引发冠状动脉粥样硬化。目前已经有多种circRNA 被发现参与了冠状动脉粥样硬化的病程。circRNA-ANRIL 被发现既通过影响核糖体RNA 引导平滑肌细胞的凋亡、阻止其增殖及促进拮抗动脉粥样硬化因子等，又通过调节腺苷核糖基化因子-细胞周期蛋白依赖激酶来对动脉粥样硬化进行正向调控[24]。Burd 等[8]发现circRNA-ANRIL 能够特异性聚集ploycomb 蛋白家族（ploycomb group，PcG），然而PcG 具有下调细胞周期素依赖性激酶4 抑制蛋白及可变读框基因表达的功能，间接诱导动脉粥样硬化。因此circRNA-ANRIL 被认为是与冠状动脉粥样硬化相关且具有研究价值的靶标，将来甚至可能具备防治疾病的功能。Zeng 等[25]发现circRNA-MAP3K5 可以吸附miRNA-22-3p，从而抑制十一易位酶-2（ten-eleven translocation-2，TET2）的表达，同时实验人员敲除小鼠心血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）中的TET2，circRNA-Map3k5 介导的对VSMC 的抗增殖作用也会受到抑制，因此，实验结果认为可能存在circRNA-MAP3K5/miRNA-22-3p/TET2 轴，其中circRNA-MAP3K5 是作为TET2介导的VSMC 分化的主要调节因子，这一发现也为内膜增生相关的疾病（包括再狭窄和动脉粥样硬化）提供新的治疗靶点及通路。

2.2 circRNA 与高血压病 原发性高血压（essential hypertension，EH）是一种以患病率高、控制率低、并发疾病多为特征的常见心血管相关疾病。目前EH的危险因素中比较明确的有年龄、饮食、地域和社会经济状态，遗传学也是目前关注的焦点。相关研究表明，ciRS-7 可以明显下调miR-7 的活性，ciRS-7/miR-7 通过影响相关靶基因受体IGF1 R，进而推动在EH 进展中生成炎症介质、改变基质成分、血管平滑肌增殖甚至血管重构[26]。肠促胰岛素家族中的IGF-1 同时也在EH 中表现出扩血管作用，相关实验已经证明患有EH 的大鼠中IGF-1 的表达相较于健康大鼠明显下调[27]。ciRS-7/miR-7 的靶基因EGFR 则通过诱导血管平滑肌增殖、血管重构参与了EH 的形成。因此circRNA 对高血压疾病进程的调控是通过调控miR-7 从而进一步影响其相关靶基因的表达来实现的。2017 年Sun 等[28]发现α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达会受到神经调节蛋白-1（neuregulin-1，NRG-1）的影响。NRG-1 作为表皮生长因子家族的成员，具有募集转录因子Ikaros 家族锌指蛋白-1（ikaros family zinc finger protein 1，IKZF-1）的能力，IKZF-1促进α-SMA 基因来源的circRNA-ACTA2 表达水平的增加，受到正向调控的circRNA-ACTA2 进一步与miRNA-548f-5p 竞争性结合，从而抑制了α-SMA 的表达。该通路被报道作用于血管内皮细胞与细胞基质，导致血管重构，从而也可以对EH 产生影响。

2.3 circRNA 与心肌梗死 心肌梗死常见于冠状动脉粥样硬化为基础疾病的患者，在多种原因诱导下斑块发生破裂，从而出现心肌急性缺血、缺氧，持续一段时间后引起心肌坏死。Geng 等[29]发现ciRS-7 参与了心肌梗死的过程，ciRS-7 针对miR-7 发挥相应“分子海绵”的生物功能，与其结合后miR-7 的活性受到负向调控，miR-7 对靶基因多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）和刺激蛋白1（stimulatory protein1，SP1）的抑制下降，从而间接通过上调靶向基因的表达促进了梗死心肌细胞的凋亡。其中SP1 属于转录因子特化蛋白/Kruppel 样转录因子家族，其家族已被报道在心肌梗死的病理生理过程中的作用不容忽视[30]。因此，针对心肌梗死的相关研究中可以将ciRS-7/miR-7 作为一个新型潜在靶点。近年来研究显示circRNA-30741 的外周血表达水平在急性ST 段抬高型心肌梗死患者中显著高于对照组（P＜0.01），同时通过分析得出circRNA-30741 通过吸附于靶miRNA（miRNA-21）参与了急性ST 段抬高型心肌梗死的病理过程[31]。

心肌梗死后血管及时再通也是指南的关键治疗方法，但血管再通后再灌注会发生相关代谢障碍、自由基增多及胞内钙超载，从而导致细胞凋亡、坏死等病理生理变化[32]。近年来通过建立小鼠心肌梗死模型也再次证明了miR-7 受到“分子海绵”的吸附抑制后，miR-7 对靶基因PARP 的抑制减弱，进而促进心肌梗死介导的细胞凋亡[33]。所以不难认为在缺血再灌注损伤的研究中更多的circRNA 将会被人们发现，并在表观遗传学的发展中逐渐明确其分子机制、信号通路及相关的生物学功能。

2.4 circRNA 与心肌肥厚及心力衰竭 心肌重构、心肌肥厚是心力衰竭的病理生理改变过程中的两个阶段，心力衰竭是整个病理生理过程的终末期事件[34]。2007 年，Carè 等[35]在对心肌肥厚调控的研究中提出，部分miRNA 的上下游路径中可能存在调节因子参与了负向调节心肌病理性肥厚相关通路的表达，使心肌肥厚进展受到阻碍，延缓或避免了终末事件的发生，因此认为通过调控心肌肥厚的相关通路可以作为心力衰竭临床研究的新方向。2015年，Wang 等[34]建立了相关小鼠模型，分为含有miRNA-223 基因的实验组小鼠和敲除miR-NA-223 基因的对照组小鼠，实验组最终发生了心肌肥大和心力衰竭，而对照组小鼠则抵抗了肥大刺激，表明miRNA-223 具备正向调节心肌肥大过程的潜能。心脏相关环状RNA（heart-related circRNA，HRCR）可以作为miRNA-223“分子海绵”，进而吸附于miRNA-223 后实现负向调节，而细胞凋亡蛋白酶募集域抑制剂（apoptosis repressor with caspase recruitment domain，ARC）作为miRNA-223 的下游靶标，ARC 的表达间接得到了促进，这样一条由HRCR、miRNA-223 和ARC 组成新型的调节通路产生了保护心肌的效果。Li 等[36]发现circRNA-000203 在经过血管紧张素Ⅱ（Angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ）处理的新生小鼠心室肌细胞（neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVC）的细胞质中表达显著增加，同时也证实circRNA-000203 的表达促进NMVC 中细胞的增大、心房利钠肽和β-肌球蛋白重链的表达，因此在该小鼠模型中，心脏功能受损，心脏肥大加重。然后又进一步发现circRNA-000203 可以在NMVC 中特异性地吸附于miRNA-26b-5p、miRNA-140-3p，miRNA-26b-5p、miRNA-140-3p，可以与Gata4 基因的3'尾随序列相互作用，而已知Gata4 基因与心脏肥大中转录程序的信号反应介质有关，所以circRNA-000203 阻断了上述过程，导致Gata4 基因水平升高，从而加剧心脏肥大。这些针对心肌肥厚和心力衰竭的研究都为临床提供了的新方向。

2.5 circRNA 与心肌纤维化 心脏纤维化的过程就是心肌细胞外基质中胶原纤维合成过多，胶原含量显著升高，导致心脏的电传导功能、收缩功能及顺应性等多方面受损。近来的研究发现，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通过作用于转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）及相关通路，进而推动心肌纤维化过程中胶原蛋白的生成。同时也发现ciRS-7 能够通过“分子海绵”的作用抑制miR-7对靶基因mTOR 的下调作用，因此可以得知ciRS-7 具有影响心肌纤维化发展的能力[37]。2017年，Zhou 等[38]发现在糖尿病小鼠心肌模型中发现circRNA-010567 可竞争性地与miRNA-141 相结合，从而抑制miRNA-141。因此，通过抑制circRNA-010567 后，使TGF-β1 在miR-141 的调控下表达水平下降，进而纤维相关蛋白在体内的表达也随之下降。总之，miR-141/TGF-β1 轴作用于纤维相关蛋白表达的过程可以受到circRNA-010567的调控，进而为研究心肌纤维化提供了新的思路。

2.6 circRNA 与其他心血管疾病 心房颤动极易形成左心房内的附壁血栓，而附壁血栓脱落后造成的栓塞是临床上十分严重的致残、致死并发症之一。新的研究发现心房颤动患者中hsa_circ_0005643 和neve_circ_0077334 表达增加，两者均被预测能够与miRNA-221-5p 结合，所以在心房颤动病理生理过程中也检测到miRNA-221-5p 整体水平下降，因此结合环状RNA 稳定性、特异性的生物学特性，miRNA-221-5p 可以作为心房颤动中值得进一步研究的生物标志物[39]。

室间隔缺损（ventricular septal defect，VSD）常见于各种原因所致胚胎时期室间隔出现发育不全，心室间血流通过室间隔的异常缺损形成左向右分流，是临床上常见的先天性心脏病。Liu 等[40]收集了在胎儿期超声诊断VSD，待胎儿流产后解剖再次确认VSD 的胎儿共6 例，将其随机分入VSD 组和非VSD 组，分析两组胎儿的心肌发现，约6 000 个差异表达的circRNA，进一步针对相关circRNA 的分析也发现了众多结合点与miRNA-30c 高度相关。相关实验提示miRNA-30c 可通过相关信号通路影响胚胎发育过程，并影响增殖和凋亡的平衡[41]。因此，这些差异表达的circRNA 被认为间接参与心脏疾病的发生和发展，具有筛查诊断VSD 的潜在临床价值。

子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期中持续进展的常见心血管疾病，极易累计孕妇全身多个器官和系统，同时也会影响到胎儿正常生长、发育，严重者会出现早产甚至死亡。Hu 等[42]通过高通量技术分析胎盘组织，发现8 000 余个差异表达的circRNA，其中PE 患者胎盘组织中hsa_circ_0036877 的表达水平低于对照组，然而，对照组中外周血的hsa_circ_0036877 表达水平反而远低于PE 患者外周血中的表达水平。相关分析显示，通过检测外周血中hsa_circ_0036877 预测PE，其灵敏度为85.3%、特异度为72.7%，提示hsa_circ_0036877 是一个潜在的预测PE 的理想生物标志物。

3 总结与展望

circRNA 具有广泛性、保守性、组织特异性等特点，并且多种circRNA、mRNA 及miRNA 构成的基因调控通路相互连接影响，构成了内容丰富的基因调控网络。随着分子生物学技术的不断发展，逐步可以进行更深层次的表观遗传方向研究，进而通过利用circRNA 对靶基因的修饰及调控，达到防治CVD 的发生并延缓CVD 发展的效果，实现对CVD筛查、诊断、治疗等。但是，目前对circRNA 的研究仍在起步阶段，无论是新circRNA 的发现还是其作用机制的探索都任重而道远。