KSHV信号膜蛋白K15的致病机制

王心琛，桂思语，华 玮,董凯旋 综述 王林定 审校

卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma, KS)是一种罕见的内皮细胞系肿瘤，也是世界上最常见的艾滋病相关恶性肿瘤之一[1]。KS是由卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)，又名人类疱疹病毒-8(human herpesvirus-8，HHV-8)引起的[2]。HHV-8首次于KS组织中通过代表性差异分析法发现，也是艾滋病感染的判定依据之一[3-4]。非洲和中东是KSHV流行率较高的地区，而美国和北欧的流行率相对较低，但传播途径尚未确定[5]。KSHV基因组中的K15基因编码K15蛋白，该蛋白可显著诱导血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和促炎性细胞因子以及环氧酶(cyclooxygenase,COX)-2、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8等趋化因子的表达[6]。目前KS的临床治疗仍面临巨大的挑战，而信号膜蛋白K15可能成为未来研究的重点。该文就K15蛋白的作用机制和研究进展做一综述。

1 概述

1.1 KS异常的血管生成、炎症反应和细胞迁移是KS的重要病理特征。KS病变早期(斑块期)会出现血管壁裂缝，引起红细胞外渗进入周围组织产生水肿，伴随含铁血黄素沉积形成紫红色外观，同时含有中性粒细胞和B细胞的炎性浸润。疾病发展至后期(结节期)，内皮细胞变异成梭形获得侵袭性并在血管缝处聚集[6-7]。

1.2 KSHV目前研究[8]表明，不仅KS由KSHV感染引起，体腔性淋巴瘤(body cavity-based lymphoma,BCBL)、原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)和多中心性牧牛人病(multicentric castleman′s disease,MCD)也与其有关。KSHV存在于已有KS病变的内皮细胞、PEL细胞、MCD的滤泡周围B细胞中，并常以潜伏期形式存在，病毒基因表达受限。KSHV拥有两种生命周期模式，即潜伏期和裂解性复制，其中KSHV裂解性复制有利于KS的发展。在KS和其他相关恶性肿瘤内皮细胞中，KSHV基因表达的病毒蛋白是强有力的信号分子，对于肿瘤的血管生成和炎症反应有重要意义[9]。

1.3K15基因与蛋白K15基因位于病毒基因组的末端，其初始转录物由8个交替拼接的外显子组成，表达KSHV基因组长独特编码区最右端的一个假定跨膜蛋白，即K15蛋白[10]。

K15蛋白是一个包含最多12个跨膜结构域和1个羧基末端的信号受体，有若干高度保守的信号模体，包括2个SH2结合位点、1个富含脯氨酸的SH3结合位点和1个TRAF结合位点[2]。既往的研究[4，11-12]表明，K15蛋白通过其羧基末端结构域和其他胞内蛋白相互作用，激活转录因子激活蛋白-1(AP-1)和活化T细胞核因子(NFAT)，从而进一步激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径、核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路。

2 K15蛋白作用机制

2.1 诱导血管新生KS早期病变的特征之一是有显著的血管生成。HHV-8初始感染和潜伏感染内皮细胞过程中，K15蛋白会靶向激活VEGF信号通路，靶点有唐氏综合征关键区域(down syndrome critical region，DSCR)-1和COX-2，从而招募多种炎症和血管生成因子[6, 13]。基质凝胶毛细管形成试验[14]提示KSHV编码的K15蛋白通过招募PLCγ1以及酪氨酸磷酸化，连续激活VEGF信号通路下游，触发NFAT通路和上调DSCR-1的下游分子，增强KSHV感染的原代内皮细胞的血管生成特性。

另外一方面，K15介导的信号通路调节分泌细胞因子和炎性趋化因子，如IL-6、CCL2、CXCL3和CXCL8，这些细胞因子都已被证实与KS发病机制有关，具有促进血管生成活性[13]。

2.2 慢性炎症微环境与晚期触发炎症反应的经典癌症不同，巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和浆细胞的炎性浸润在KS早期(斑块期)已经非常丰富。细胞经HIV感染后生成的的炎性细胞因子(如干扰素(interferon,IFN)-γ)已被证实能够体外诱导KSHV溶解再活化和内皮细胞活化，因此艾滋病患者的慢性炎症微环境可能有利于KS的发展[6]。

2.2.1NF-κB信号通路的激活 NF-κB是一种多效性功能诱导型转录因子，通过调节细胞因子、生长因子和效应酶的表达参与细胞增殖分化、免疫反应、炎症以及肿瘤转化等生物过程。哺乳动物的NF-κB家族由5个成员组成，p50和p52(Ⅰ类)、p65/RelA、c-Rel和RelB (Ⅱ类)。p50和p52分别由p105和p100经蛋白酶水解加工后产生。而大多数细胞中的NF-κB因子通常是p50/p65异源二聚体[15]。静息态细胞中核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)能够阻止NF-κB进入胞核，而NF-κB激活后可诱导IκB蛋白的磷酸化，并通过泛素-蛋白酶体途径将其快速降解。经典途径通常诱导p50-p65二聚体从IκB介导的储存库中释放，替代途径则促进p52-RelB二聚体在细胞核中的积累[16]。NF-κB诱导激酶(NF-κB inducing kinase，NIK)可调节p100的磷酸化和水解，使其形成p52后再转位入胞核。因此，NIK的含量是激活该通路的关键步骤[17]，正常情况下，NF-κB诱导NIK保持较低水平。以前的研究[11]表明K15蛋白可能是一个受泛素化调控且具有持续活性的NF-κB活化因子，其与负性NIK的共表达会导致NF-κB反应启动子的激活减少，可能有助于调节KSHV感染细胞中NF-κB介导的细胞炎症基因的表达。NF-κB途径也已被证明在其他病毒诱导慢性炎症的过程中存在，例如HHV-4潜伏膜蛋白(latent membrane protent,LMP)1以NIK依赖的方式激活NF-κB通路。

2.2.2诱导炎症基因表达 K15蛋白在KSHV潜伏感染的B细胞中能够激活炎症基因的表达，如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-3和COX-2。其中COX-2是KSHV感染原代内皮细胞时诱导的强有力的炎症介质之一。K15通过上调COX-2的表达可促进炎性细胞因子、趋化因子和生长因子的分泌，介导炎性细胞的招募[6, 10, 18]。

2.3 延长感染细胞寿命

2.3.1下调B细胞受体信号 KSHV与EB病毒同属γ疱疹病毒亚科，二者DNA序列有高度同源性[19]。与其他疱疹病毒一样，KSHV主要在B细胞中建立潜伏感染[13]。有研究[12]显示CD8分子与K15胞质结构域融合的结合体在Y481EEV模体的Y481位点产生磷酸化，从而下调B细胞受体(BCR)信号转导，抑制胞内钙动员和受感染B细胞凋亡，延长病毒潜伏期。也有学者发现EB病毒基因组编码的蛋白LMP2A能够维持记忆B细胞的潜伏期，BCR的下游效应子(如Lyn)能够通过SH2结构域识别磷酸化的LMP2A YEEA模体[20]。而LMP2A可以调节Lyn活性，因此LMP2A是将抗原受体活化信号转化为钙动员和激活MAPK途径的关键因素[21]。此外，有研究[4]显示在重组疱疹病毒的转基因小鼠中，K15胞质区抑制BCR近端酪氨酸磷酸化，进而阻断Ca2+内流。K15蛋白的拓扑结构与LMP2A类似，因此可能激活某些相同的信号通路[10]。

2.3.2抗细胞凋亡 HS1相关蛋白X-1(HS1-associated protein X-1,HAX-1)是一种新型的细胞凋亡调节蛋白，具有与凋亡调控基因B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma，Bcl)-2编码蛋白同源的结构域，二者可以在体内形成同源二聚体，二者可以在体内形成同源二聚体，阻断促凋亡蛋白Bax诱导的细胞凋亡，还拥有调节肌动蛋白细胞骨架运动的功能[14-15]。K15蛋白不仅与HAX-1相互作用，还可以诱导多种抗凋亡基因的表达，如A20、Bcl-2A1，大大提高了细胞增殖，转移及生存能力，有助于延长KSHV感染细胞的存活时间[13]。

Bcl-2同源基因BHRF1和BALF1均于EB病毒感染潜伏期内高表达，且表达产物与LMP2A协同发挥抗凋亡作用[4]。因此猜测K15蛋白可能也通过与类似抗凋亡蛋白的相互作用，对抗不同的促凋亡信号抑制细胞凋亡。

2.3.3维持病毒潜伏期 转录因子NF-κB参与维持病毒潜伏期，也有抑制病毒裂解的作用。K15蛋白最有可能通过其胞质结构域的SH2结合位点YEEV模体中的Y481以及NIK和IκB激酶复合体的膜近端氨基酸磷酸化，激活IκB激酶复合物，从而活化NF-κB。因此SH2结合模体YEEV在延长病毒潜伏期中占据重要地位[18]。

K15基因属于典型的早期裂解基因，主要在病毒裂解周期中表达。但在潜伏期的KSHV阳性PEL细胞中也发现了该基因，诱导病毒进入裂解周期后其表达增加。因此可以猜测K15基因可能根据病毒处于潜伏期或裂解期适当调节表达量，通过转导促生存信号提高细胞活性[13]。

2.4 促进细胞迁移和侵袭肿瘤细胞的异常迁移会导致病灶转移，这是大多数癌症患者死亡的主要原因[10]。在晚期KS病变中，KSHV感染的内皮细胞失去正常形态变成纺锤形并获得侵袭特性[14]。与其他疱疹病毒一样，大多数KSHV感染的细胞处于潜伏期，只有少部分潜伏感染的细胞自发性溶解再激活，将病毒传播至易感细胞，如B细胞和T细胞[21]。此外，裂解感染的细胞合成的细胞因子一般以旁分泌方式促进病理性血管生成和潜伏感染细胞的侵袭[14]。K15蛋白会上调与细胞迁移有关的基因表达，诱导几种已知参与细胞运动的蛋白质的生成[4]。实验研究[10]证明K15可以通过激活MMP-1、MMP-2、MMP-9和AP-1提高原代人脐静脉内皮细胞的侵袭性。

2.4.1K15蛋白与PLC γ1的相互作用 K15蛋白通过招募和激活细胞蛋白PLCγ1及其下游效应分子βPIX、GIT1和cdc42，显著提高病毒潜伏期内皮细胞的侵袭性。研究[14]已经证明GIT1与βPIX能够形成稳定的复合体并充当PLCγ1诱导的蛋白复合体，即PLCγ1-GIT1-βPIX-cdc42复合体的支架。PLCγ2 cSH2结构域作为显性抑制物，能够以剂量依赖的方式抑制K15蛋白对于PLCγ1的招募和激活。K15蛋白与PLCγ1相互作用是受感染内皮细胞获得侵袭性所必需的条件，发挥负调节作用的PLCγ2 cSH2结构域可能作为一个重要的治疗靶点。

2.4.2K15P与K15M的重要作用K15基因可分为P、M和N三种基因型，其中K15P与K15M有33%的氨基酸同源性，在功能上基本等效[10]。已有研究[4]表明，K15P通过诱导钙库操作性钙离子通道(store-operated calcium entry，SOCE)的重要膜蛋白Orail1的形成参与Ca2+信号转导，并促进细胞迁移。研究[10]表明K15M在KSHV阳性的PEL细胞中潜伏表达，通过其SH2结构域定位于细胞溶酶体膜，诱导细胞迁移和侵袭，同时提高NF-κB的活性。K15M可能通过负调节miR-21和miR-31的胞内含量参与KSHV介导的肿瘤转移。K15M是否通过调节溶酶体膜的通透性从而影响组织蛋白酶的释放还未得到实验验证，但这仍可能是一种治疗KSHV相关癌症的新方法。

3 展望

K15可激活细胞的Ras/MAPK和NF-κB通路，并弱激活JNK/SAPK通路，上调细胞因子和趋化因子的表达，引起免疫和炎症效应。K15蛋白招募并激活PLCγ1，提高原代内皮细胞的血管生成活性，同时以PLCγ1-GIT1-βPIX-cdc42复合物的方式促进KSHV感染的内皮细胞迁移和侵袭，因此可以成为治疗KS的有效靶点。K15蛋白与抗凋亡蛋白HAX-1之间的相互作用可以有效延长细胞寿命，也可成为治疗KS的突破点。大部分情况下K15蛋白通过羧基末端结合的模体与特定的宿主蛋白相互作用，促进病毒感染和扩散。对其致病机制的深入研究依据，可能为开发新型抗病毒和抗感染药物提供依据。