肝细胞癌组织TROAP表达与上皮-间质转化的相关性

于 澜， 徐缨龙， 李 明， 肖渝清

成都市第三人民医院肝胆外科，四川 成都 610031

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第五大常见的恶性肿瘤，近几十年来发病率不断上升，其死亡率位居恶性肿瘤第三位[1]。随着医疗水平的进步，HCC患者预后得到了一定程度的改善，目前根治性手术切除是治疗HCC的主要方式，但术后易发生复发转移，导致多数患者预后不佳，因此，探究影响HCC患者复发转移的因子意义重大[2]。Trophinin相关蛋白(Trophinin-associated protein，TROAP)最初于胚胎滋养层细胞中分离，其可在早期胚胎植入中发挥作用，并伴随快速的细胞侵袭和增殖[3]。TROAP不仅与胚胎植入有关，还可在细胞有丝分裂期间参与调节纺锤体的形成，TROAP过表达导致单极纺锤体形成，其表达下降可导致有丝分裂阻滞并诱导多极纺锤体的形成[4]。近来研究[5-6]发现，TROAP在人类癌细胞系中高度表达，但关于TROAP在癌症发展中的作用研究较少。Jiao等[5]研究发现，TROAP在肝癌组织中过度表达，其高表达患者中位总生存期较低表达患者短，TROAP可作为预测肝癌患者总生存期的独立变量。此外，TROAP可促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移[6]，但TROAP在HCC上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程中作用尚不明确。本研究通过检测TROAP及EMT相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin，CDH1)、波形蛋白在HCC组织及癌旁组织中的表达，初步探讨TROAP与HCC患者EMT、临床病理特征的关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2014年1月至2016年2月在成都市第三人民医院行根治性肝癌切除术的97例HCC患者，男75例，女22例，年龄(53.18±12.46)岁(36～78岁)，收集所有患者的HCC组织及相应的癌旁组织(距癌组织4 cm以上)。纳入标准：(1)病理检查确认为HCC；(2)术前无介入治疗、放化疗史；(3)患者或家属知情同意。排除标准：(1)术后出现胆漏、肝功能衰竭、大出血等严重并发症者；(2)合并精神疾病者；(3)合并其他恶性肿瘤者；(4)临床资料不齐全者。本研究经医院伦理委员会审批同意(批号：20131205)。

1.2 主要试剂兔抗人TROAP单克隆抗体(货号：H00010024-K)，购自亚诺法生技股份有限公司(Abnova)；鼠抗人FZR1/CDH1单克隆抗体(货号：H00051343-M02)，购自美国Novus Biologicals公司；鼠抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(货号：ANT-246)，购自艾美捷科技有限公司；抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(货号：KIHC-1)，购自上海恒斐生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样本采集：在肝癌根治性切除术中，收集患者的新鲜HCC组织及癌旁组织(距癌组织4 cm以上)，制备成石蜡切片(4 μm)备用。

1.3.2 免疫组化法检测HCC组织及癌旁组织中TROAP、CDH1及波形蛋白表达：石蜡切片经脱蜡、水化后，于3% H2O2中灭活内源性过氧化物酶，并用微波炉修复抗原。滴加一抗(TROAP、CDH1、波形蛋白单克隆抗体)50 μl至切片上，4 ℃孵育过夜，滴加二抗37 ℃孵育30 min，经DAB显色、复染后，酒精梯度脱水干燥、二甲苯透明、封片，于镜下观察结果。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3.3 结果评定：每张切片在显微镜下随机选取5个高倍镜(放大400倍)视野，每个视野计数100个细胞，统计阳性细胞数。细胞膜或细胞质存在棕黄色颗粒记为阳性细胞，其中波形蛋白、TROAP着色于细胞质，CDH1着色于细胞膜。着色强度为0、1、2、3分，分别对应无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色；根据阳性细胞所占百分比分为：≤5%为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分。以上两种计分相乘得出总分，总分<4分为阴性表达，≥4分为阳性表达。

1.3.4 GEPIA数据库分析：基于GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TROAP在HCC组织及正常组织中的表达情况，以及TROAP表达水平与HCC患者预后的关系。

1.3.5 随访：对所有患者进行术后随访，采用门诊复查、电话或微信等方式，开始时间为术后第1天，截至患者死亡或2021年3月，记录患者的生存情况。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。计数资料以例数/%表示，组间比较采用χ2检验；Spearman法分析TROAP蛋白与CDH1、波形蛋白表达的相关性；采用Kaplan-Meier法分析TROAP蛋白表达情况与患者生存率的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织及癌旁组织中TROAP、CDH1及波形蛋白的表达情况基于GEPIA数据库，HCC组织TROAP mRNA水平明显高于正常组织(P<0.05，见图1)。HCC组织中TROAP蛋白及波形蛋白的阳性率高于癌旁组织(P<0.05)，CDH1蛋白阳性率低于癌旁组织(P<0.05，见表1、图2～4)。

表1 HCC组织及癌旁组织中TROAP、CDH1及波形蛋白的表达情况 [例数(%)]

注：*P<0.05。

注：A：HCC组织中TROAP蛋白表达；B：癌旁组织中TROAP蛋白阴性表达。

注：A：HCC组织中CDH1蛋白表达；B：癌旁组织中CDH1蛋白阴性表达。

注：A：HCC组织中波形蛋白表达；B：癌旁组织中波形蛋白阴性表达。

2.2 TROAP表达与HCC患者临床病理特征的关系TROAP蛋白阳性率与HCC患者的Edmondson分级、TNM分期、淋巴结转移及肿瘤结节数目有相关性(P<0.05)，而与患者年龄、性别、肿瘤最大直径、Child-Pugh分级、甲胎蛋白及乙肝表面抗原是否为阳性无相关性(P>0.05，见表2)。

表2 TROAP表达与HCC患者临床病理特征的关系

续表2

2.3 HCC组织中TROAP蛋白与CDH1、波形蛋白表达的相关性Spearman法分析显示，TROAP蛋白表达与CDH1表达呈负相关(P<0.05)，与波形蛋白表达呈正相关(P<0.05，见表3)。

表3 相关性分析

2.4 TROAP蛋白表达对患者预后的影响通过查询GEPIA数据库可知，HCC患者中TROAP高表达患者累积生存率明显低于TROAP低表达患者(P=0.0039，见图5)。本研究中，采用Kaplan-Meier法分析TROAP蛋白表达情况与患者生存率的关系，结果与数据库一致，TROAP蛋白阳性表达者累积生存率29.4%明显低于阴性表达者的63.8%，两组比较Log-rank值为5.889(P=0.015，见图6)。

图5 GEPIA数据库中TROAP蛋白表达与

图6 TROAP蛋白表达与HCC患者生存的关系Fig 6 Relationship between TROAP protein expression

3 讨论

HCC是全球所面临的公共卫生问题，每年新增病例约80万例，其中男性发病率明显高于女性，HCC患者预后极差，肿瘤侵袭、转移是影响HCC患者生存率的主要原因[7]。EMT是肿瘤转移的关键过程，肿瘤细胞从上皮表型转化为间质表型，从而获得更强的侵袭能力。在侵袭转移级联过程中，EMT可给予非侵袭性的肿瘤细胞转移潜能，并促进侵袭性肿瘤细胞的迁移，在新转移灶启动转移克隆生长[8-9]。HCC患者预后不良的主要原因是癌细胞具有无限生长能力，并能够依赖EMT过程转移至病变组织周边和全身。在EMT过程中，细胞间粘附能力减弱，细胞侵袭能力增强，CDH1表达下降或缺失是EMT最显著的特征，CDH1也可作为患者预后不良和转移的预测指标[10]。波形蛋白可维持细胞完整性、抵御外界应急损伤，是EMT的标志物，其在肝癌组织中表达增加，且与患者TNM分期、转移复发、肿瘤结节数有关，参与影响患者的预后[11]。本研究结果显示，HCC组织中CDH1蛋白阳性率低于癌旁组织，波形蛋白的阳性率高于癌旁组织，提示患者癌组织存在EMT，癌细胞粘附能力下降，易脱离原病灶，发生转移。

TROAP蛋白由778个氨基酸残基组成，是一种微血管细胞骨架调节所需的细胞质蛋白，富含脯氨酸，人TROAP基因定位于12q13.12染色体处，TROAP蛋白参与人类胎盘植入和早期胎盘发育，且可在有丝分裂期间参与纺锤体组装、调节中心体完整性[12]。Trophinin是一种膜蛋白，具有自结合活性，可介导同质细胞粘附，TROAP是Trophinin显示细胞粘附活性所需的细胞质蛋白，在滋养层细胞中，一旦Trophinin与细胞质中的TROAP结合，Trophinin的胞外域即可作为细胞粘附分子发挥作用，胎盘细胞与母体上皮细胞初始附着后可诱导更强的粘附，且在胚胎植入部位可观察到明显的形态变化，胚胎植入过程中滋养细胞的攻击行为与恶性肿瘤细胞类似，因此可能存在某些共享机制[3]。近年来发现，TROAP可参与多种恶性肿瘤的发生发展。Ye等[13]研究发现，敲低结肠癌细胞中TROAP的表达，可显著抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞周期G0/G1期停滞，并促进癌细胞凋亡。Chen等[14]研究发现，高水平TROAP的肺腺癌患者其淋巴结转移、远处转移占比高于低水平TROAP患者，且高水平TROAP患者临床分期更高、生存时间更短，TROAP表达是肺腺癌患者预后的独立标志物。本研究结果显示，HCC组织中TROAP阳性表达率明显高于癌旁组织，与Li等[15]研究结果一致，且其表达与CDH1表达呈负相关，与波形蛋白表达呈正相关，提示TROAP可能参与HCC患者的EMT过程。研究发现，HCC患者癌组织中TROAP mRNA显著升高，其上调与肿瘤数目、分化程度有关，且其表达与患者临床严重程度呈正相关[16]。本研究还显示，TROAP蛋白阳性率与HCC患者的Edmondson分级、TNM分期、淋巴结转移及肿瘤结节数目有关，进一步提示TROAP可能参与EMT过程，其表达升高可能使癌细胞粘附能力发生改变，导致癌细胞脱离原发病灶，从而引发转移、结节数目增加等。此外，TROAP蛋白阳性患者5年累积生存率明显低于阴性患者，表明TROAP水平对于预测HCC患者预后有一定价值。

综上所述，HCC患者癌组织TROAP蛋白阳性率高于癌旁组织，且TROAP表达与EMT过程有关，有成为判断HCC患者预后标志物的潜力。然而，TROAP在HCC患者中表达失调的分子机制仍有待进一步探究。