贵州凯里酸汤食用频次对大鼠非酒精性脂肪性肝病的影响及机制研究

李正超， 丛 硕， 刘咏梅， 胡亚欣， 朱紫馨， 程明亮

1.贵州医科大学临床医学院，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附属医院感染科

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是全球最常见的慢性肝病之一，我国人群患病率为29.81%，其中2%～3%会发展为非酒精性脂肪性肝硬化，中东地区(32%)和南美洲(30%)的NAFLD患病率最高，非洲最低(13%)[1-2]。大数据显示，NAFLD患病率仍处于持续上升阶段，并且年轻化、大众化趋势日益显著[3]。

凯里酸汤为贵州省非物质文化遗产，是一种少数民族传统工艺发酵食品。由辣椒、番茄和糯米经二次发酵制作而成[4]。课题组前期调查研究发现，黔东南地区人群喜食凯里酸汤，其NAFLD的患病率(18.19%)明显低于贵州省平均水平(23.92%)[5]和我国(29.81%)平均水平，且运动和酸汤饮食因素成为该地区NAFLD患病的保护性因素。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR)是一种新型甾体类激素受体，包括PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ三种亚型[6]。其中PPAR-α为一种核受体蛋白，可被脂肪酸及一些过氧化物酶增殖剂激活，参与调控免疫反应和脂质代谢[7]。固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)是调节与脂质代谢基因表达的关键核转录因子，SREBP-1c是肝脏脂质代谢的关键调控者，几乎参与肝脏所有TG和脂肪酸合成基因的转录[8]。有研究[9]表明，PPAR-α的激活将抑制SREBP-1c途径。

NAFLD至今仍无特效的治疗药物，目前改善的方法仍以生活方式的改变和饮食习惯的调整为主[10]。因此，本研究拟探讨贵州凯里酸汤不同食用频次对NAFLD大鼠的影响，并观测PPAR-α/SREBP-1c在凯里酸汤干预非酒精性脂肪形成过程中的调控机制，旨在明确贵州凯里酸汤食用频次对NAFLD的影响，为NAFLD的防治提供更加明确的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：32只7周龄SD雄性大鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001，所有动物实验均经贵州医科大学动物实验伦理委员会批准(批号：1901001)，符合实验室动物管理与使用准则。

1.1.2 试剂与仪器：凯里酸汤由贵州凯里亮欢寨餐饮娱乐有限公司提供。TLR4(76B357.1)、p-STAT1(ab109461)、Zo-1(ab190085)、Occludin-1(ab216327)、β-actin(ab8226)一抗购自Abcam公司。兔二抗体(PMK-014-102)购自普美生物。HE染色(C0105S)及油红O(C0157S)染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(P0012S)、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(P0690)购自碧云天生物有限公司。PCR试剂盒(BL698A)购自擎科生物有限公司。垂直电泳仪(WIX-miniPRO4)购自韦克斯生物有限公司。高速离心机(1-14K)购自成都格朗科技。实时荧光定量PCR仪(罗氏Light Cycler 480)购自北京龙跃生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NAFLD大鼠造模及酸汤干预：将32只SPF级7周龄雄性SD大鼠适应性喂养1周后随机分为4组:正常对照组(ND组，n=8)、高脂模型组(HF组，n=8)、高脂饮食+每天灌胃酸汤组(HS1组，n=8)、高脂饮食+隔天灌胃酸汤组(HS2组，n=8)。固定时间将酸汤煮沸后冷却至室温再行灌胃，每次灌胃剂量为1 ml/100 g，非干预组用等体积双蒸水灌胃。各组大鼠均自由进食和饮水。

1.2.2 采集标本：每周三称量大鼠体质量并记录，观察各组小鼠皮毛、色泽、精神面貌、饮食等情况。12周末，10%水合氯醛0.6 ml/100 g腹腔注射麻醉，剖开胸腹，心脏穿刺取全血，取肝脏、回肠组织。

1.2.3 生化及血清ELISA：将全血置于低速离心机4 000 r/min离心5 min，取上清，采用全自动生化分析仪检测生化指标，并用ELISA试剂盒检测血清IL-6、IL-8、TNF-α水平。

1.2.4 肝脏组织病理学：将肝脏组织用4%多聚甲醛溶液固定48 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制成石蜡切片，然后用HE染色试剂盒进行染色，中性树胶封片固定，光学显微镜检查并取图。液氮中肝组织制成冰冻10 μm切片，根据油红O试剂说明进行染色，苏木素复染，荧光显微镜下观察并取图。

1.2.5 组织蛋白表达水平检测：采用Western blotting法检测组织中蛋白的表达水平，取0.04 g肝肠组织，裂解液裂解得到总蛋白，测得蛋白浓度，配制2 μg/ml蛋白浓度溶液，用SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳，并转膜至PVDF膜上，封闭，一抗孵育过夜，二抗孵育2 h，Bio-Rad凝胶成像系统成像。本实验以β-actin作为内参。

1.2.6 qRT-PCR检测基因PPAR-α及脂质代谢SREBP-1c mRNA的表达：取新鲜肝脏30 mg，利用RNA提取试剂盒提取总mRNA，逆转录成cDNA，随后使用qRT-PCR扩增，使用2-ΔΔCT计算各组基因的mRNA相对表达量。引物序列如表1所示。qRT-PCR反应溶解曲线呈单峰为特异。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1 酸汤干预对NAFLD大鼠肝脏损伤及血脂水平的影响血清生化检测显示，与ND组比较，HF、HS2组大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平显著升高(P<0.05)，HDL-C水平显著降低(P<0.05)；HS1组ALT、AST水平显著升高，TC、TG、LDL-C、HDL-C水平差异无统计学意义(P>0.05)；与HF组比较，HS1组上述所有指标明显改善(P<0.05)，HS2组TC、TG、LDL-C、HDL-C明显改善，且HS1组比HS2组改善显著(P<0.05)(见表2)。

表2 各组SD大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较

2.2 酸汤干预对NAFLD大鼠血清炎性因子水平的影响ELISA检测血清炎性因子水平显示，与ND组比较，HF组、HS1组、HS2组IL-6、IL-8、TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与HF组比较，酸汤干预后HS1组IL-6、IL-8、TNF-α水平显著降低(P<0.05)，HS2组IL-6、IL-8显著降低(P<0.05)，与HS2组比较，HS1组IL-6、IL-8、TNF-α水平显著降低(P<0.05)(见表3)。

2.3 酸汤干预对NAFLD大鼠肝脏病理学的影响ND组大鼠肝脏肝小叶结构完整，分界明显，肝细胞索排列整齐，形态清晰，肝细胞体积大，胞质丰富透明，胞核大而圆，居中，异染色质少而着色浅，无明显红色脂滴；HF组大鼠肝细胞形态不规则，胞质内大量脂肪空泡，肝细胞索排列紊乱，HS1组中肝细胞形态清晰，镜下少量红色脂滴沉积，肝细胞索排列整齐，HS2组脂滴较HF组少，肝细胞索排列仍紊乱，改善程度明显低于HS1组(见图1)。

表3 各组SD大鼠血清中炎症因子水平对比

图1 肝脏组织病理学 HE及油红O染色(放大200倍)Fig 1 HE and oil red O staining of liver histopathology

2.4 酸汤干预对NAFLD大鼠肝组织TLR4、p-STAT1蛋白表达的影响与ND组比较，HF组、HS2组肝脏组织炎症相关蛋白TLR4、p-STAT1表达量显著升高(P<0.05)，HS1组上述蛋白表达变化不显著，差异无统计学意义(P>0.05)；与HF组比较，HS1组上述蛋白表达量显著降低(P<0.05)，HS2组变化不显著，差异无统计学意义(P>0.05)；与HS2组比较，HS1组显著降低(P<0.05)(见图2、表4)。

图2 各组大鼠肝脏TLR4、p-STAT1蛋白表达Fig 2 Expressions of TLR4 and p-STAT1 in the liver of

2.5 酸汤干预对SD大鼠肠道的影响及肠壁通透性相关蛋白的表达HE染色显示，ND组肠道绒毛整齐排列，结构完整。HF组绒毛部分出现断裂、融合，腺体扩张，绒毛水肿，上皮细胞水肿，核增大。HS1组肠道绒毛排列整齐，无断裂、融合、无水肿，结构完整。HS2绒毛断裂较少，腺体扩张不明显，介于HF组与HS1之间(见图3)。

利用Western blotting检测肠壁通透性蛋白Zo-1、Occludin-1蛋白。与ND组比较，HF、HS2组大鼠组织Occludin-1、Zo-1蛋白显著降低(P<0.05)，HS1组上述指标变化不显著，差异无统计学意义(P>0.05)；与HF组比较，HS1组Occludin-1、Zo-1蛋白显著升高(P<0.05),HS2组Zo-1蛋白显著升高(P<0.05)，且HS1组比HS2组显著(P<0.05)(见图4、表4)。

图4 各组大鼠回肠Zo-1、Occludin-1蛋白表达Fig 4 Expressions of Zo-1 and Occludin-1 in the

2.6 酸汤干预对肝脏PPAR-α及脂质代谢SREBP-1c mRNA的表达脂质代谢相关基因据qRT-PCR结果显示，与ND组比较，HF组肝脏组织SREBP-1c mRNA水平显著升高(P<0.05)，PPAR-α mRNA水平显著降低(P<0.05)；与HF组比较，HS1、HS2组SREBP-1c mRNA的表达水平显著降低(P<0.05)，HS1组PPAR-α mRNA水平显著升高(P<0.05)，且上述指标HS1组比HS2组显著(P<0.05)，HS2组PPAR-α mRNA水平变化不显著,差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表4 qRT-PCR和Western blotting分析结果

3 讨论

贵州凯里酸汤成分丰富，邹大维[11]利用高效液相色谱对贵州凯里酸汤进行测定显示，其中富含番茄红素、辣椒碱、有机酸乳酸、乙酸、酒石酸、柠檬酸、矿物质Ca、P等。本实验中采用煮熟贵州凯里酸汤，其丰富的营养成分在本研究中起着重要作用。

NAFLD的发生发展主要受脂质代谢、胰岛素抵抗、遗传等多因素影响，与肥胖、糖尿病等多种代谢综合征密切相关，当机体出现胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱时，易导致代谢综合征，脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱，脂质在局部组织部位过度浸润，过多地沉积在肝细胞内，脂质物质代谢障碍造成脂肪微滴堆积在肝细胞内，逐步累积进而形成脂肪肝，导致不同程度的肝变性、坏死及炎性反应[12]。本研究中使用高脂饮食诱导SD大鼠构建NAFLD模型，与ND组比较，HF组ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，且肝脏组织炎性病变及大量脂滴沉积，提示造模成功。酸汤干预后，上述生化指标明显改善，且HS1较HS2显著，肝脏组织炎性病变减轻，脂质沉积减少，但HS1、HS2组与ND组比较，上述部分指标差异仍显著，表明酸汤干预并未使NAFLD大鼠恢复至健康水平。证明了贵州凯里酸汤具有改善高脂饮食诱导的NAFLD模型，且每天酸汤干预效果更显著，但并未使之恢复至健康水平。

IL-6可由单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞等多种细胞分泌并进入肝脏，促进肝脏三酰甘油分泌，并抑制脂蛋白酯酶，阻止脂质分解，进而加剧脂质代谢紊乱[13]。TNF-α是脂蛋白酯酶抑制剂，可减少外周脂肪组织分解，促进TG的合成和聚集，加重脂质的沉积[14]。IL-8促进炎症细胞如中性粒细胞聚集至肝脏引起炎症，脂质沉积在肝细胞中也可刺激Kupffer细胞释放TNF-α，并促进IL-8的产生，并参与肝脏炎症反应，导致肝脏损伤[15]。当肝脏代谢紊乱时，聚积的脂质刺激巨噬细胞分泌炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α，这些炎性因子是参与炎症反应相关的重要介质，激活炎症级联反应，引起机体炎症反应和组织损伤[16]。本研究显示，贵州凯里酸汤显著改善肝脏代谢紊乱，降低脂质沉积，降低血清炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α水平。且HS1组较HS2组效果显著。但HS1、HS2组与ND组比较，上述指标差异仍显著，表明酸汤干预并未使NAFLD大鼠恢复至健康水平。证明贵州凯里酸汤可降低血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α水平，且每天酸汤干预效果更显著。

“肠-肝轴”理论将肠道与肝脏紧密联系[17]。二者通过门静脉紧密联系，肠道血液经门静脉回流入肝脏，肝脏产生并分泌胆汁排入小肠。机体正常情况下肠黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障与生物屏障共同构成，其中以机械屏障最为重要，由完整的肠黏膜上皮细胞及上皮细胞间的紧密连接相关蛋白Zo-1、Occludin-1等形成[18]。NAFLD大鼠肝脏脂质大量沉积，可激活TLR4通路，造成各种炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α分泌增加，肝脏分泌的各种炎性因子通过肠-肝循环进入肠道，引起肠道炎症级联反应，造成肠黏膜屏障破坏，同时肠道内毒素通过肠黏膜入血，经门静脉到达肝脏，进一步激活TLR4通路，形成恶性循环[19]。本研究中，酸汤干预后，肠绒毛断裂、融合明显减少，腺体扩张、绒毛水肿、上皮细胞水肿程度明显改善，HS1组肠壁通透性相关蛋白表达显著改善，HS2组未见明显改善。证明了贵州凯里酸汤可缓解NAFLD引起的肠黏膜屏障破坏，且每天酸汤干预效果更显著。

TLR4是一种细胞表面TLRs，在肝星状细胞膜上表达，与炎症刺激的稳态失衡相关[20]。PPARs属于类固醇/甲状腺剂/维甲酸受体超家族，可调控许多维持能量平衡的代谢过程，包括脂肪细胞分化、炎症、脂蛋白代谢和脂肪酸氧化，PPAR-α是一种核蛋白受体，参与NAFLD脂质代谢及炎症反应过程，PPAR-α通过激活线粒体和调节过氧化物酶体脂肪酸氧化途径在脂质转运和代谢调节中起着至关重要的作用[21]。PPAR-α通过LXR途径调节SREBP-1c的转录水平，调控乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合成酶活性，促进脂肪酸的分解代谢[22-24]。当PPAR-α被抑制表达时，脂肪酸代谢障碍，肝脏大量脂肪沉积，代谢紊乱，导致活性氧形成、内质网应激、肝细胞损伤，导致脂毒性炎症产生，脂毒性激活TLR4/p-STAT1途径，引起炎症反应，同时通过肠-肝循环，肝脏炎性因子进入肠道，导致肠道炎症，肠壁通透性增大。本研究显示,酸汤干预组PPAR-α上调，使SREBP-1c mRNA的表达水平降低,改善脂质代谢紊乱导致的炎性反应，降低了肝脏TLR4、p-STAT1的表达，并降低了血清中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α的水平，具有改善炎症反应的功效，并改善肠壁通透性，且HS1组比HS2组显著。

综上所述，贵州凯里酸汤改善NAFLD的机制可能是通过上调PPAR-α/SREBP-1c改善NAFLD脂质代谢，缓解因脂质代谢紊乱导致的炎症反应。且改善效果与食用频次呈正相关。但本实验并未对贵州凯里酸汤进行有效成分提取与验证，亟需进一步研究。