外周血环状RNA CDR1as在动脉粥样硬化中的诊断价值

张晗 李兴 赵乐 杨挲挲 韩鹏飞

1.黑龙江省牡丹江医学院第一临床医学院，黑龙江牡丹江 157011；2.黑龙江省牡丹江医学院附属红旗医院检验科，黑龙江牡丹江 157011

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症性疾病，特征为血管壁进行性增厚，它引起的冠心病、脑卒中和外周血管病等疾病，已成为世界人口死亡的首要原因[1]。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类不具有5′和3′末端闭合环状结构的非编码RNA，高通量测序和生物信息学方法分析发现其广泛存在于真核细胞转录组中[2]。circRNA CDR1as已被证明参与多种疾病的病理进展，如CDR1as能够促进肝癌[3-4]、肺癌[5-6]等肿瘤的进展，同时也能够抑制膀胱癌[7]和卵巢癌[8]等肿瘤的进展。然而CDR1as在AS中的作用尚不清楚。本研究通过检测AS患者和健康人外周血单个核细胞中CDR1as的差异表达，探讨其在AS病理过程中可能发挥的作用及其对AS的诊断价值，旨在为AS寻找新型分子标志物及潜在的防治靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年9月至2021年1月的牡丹江医学院附属红旗医院的20例AS患者及同期就诊的20名健康体检者作为研究对象。根据颈动脉超声检查结果是否形成动脉粥样斑块，将研究对象分为健康组和AS患者组。健康组20例，其中男9例，女11例；年龄47～64岁，平均（53.75±3.85）。AS患者组20例，其中男12例，女8例；年龄48～61岁，平均（55.50±4.02）岁。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），且为同时期和同地区收集，具有可比性。本研究经牡丹江医学院附属红旗医院医学伦理委员会批准（编号：202177），且研究对象均签署知情同意书。AS患者组纳入标准：①年龄45～65岁；②经颈动脉超声检查诊断为动脉粥样斑块形成。排除标准：①有不稳定型心绞痛、急性心肌梗死或其他心脏瓣膜疾病的患者；②恶性肿瘤或严重感染的患者；③有器官移植史的患者；④有免疫系统疾病的患者。健康组纳入标准：①年龄45～65岁；②经颈动脉超声检查确定无AS斑块。排除标准同上。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂人全血单个核细胞分离液（Ficoll配置）（P9011）购自北京索莱宝科技有限公司；RNA提取试剂盒（R6812-02）购自美国OMEGA公司；逆转录试剂盒（04896866001）、SYBR Green Master Mix（04913 914001）购自美国Roche公司。

1.2.2 人全血单个核细胞分离向15 ml离心管中加入3 ml分离液，再缓慢加入1～2 ml全血，室温，800×g，离心22 min；吸取单个核细胞层到另一15 ml离心管中，加入10 ml PBS缓冲液，混匀细胞，室温，250×g，离心10 min；弃上清，以5 ml PBS缓冲液重悬细胞，室温，250×g，离心10 min；重复上一步，弃上清后进行总RNA提取。

1.2.3 总RNA提取及逆转录RNA提取的整个操作过程严格按照OMEGA试剂盒说明书进行；使用Nanodrop 2000超微量分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，A260/280在1.8～2.2之间的样本进行逆转录；使用Roche逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，置于-80℃冰箱保存。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RTqPCR）本研究采用SYBR Green染料法进行RTqPCR检测，以GAPDH作为内参基因，采用公式2-ΔΔCt计算各样品目的基因的相对表达量。扩增条件：95℃10 min（预变性），1个循环；95℃10 s（变性），60℃1 min（退火延伸），40个循环；使用仪器默认的熔解曲线分析程序。引物由广州锐博生物技术有限公司设计合成，CDR1as-F：5′-CAGTGTCTGCAATATCCAGGGTT-3′；CDR1as-R：5′-TTGGAAGACTTGAAGTCGCTGG-3′；GAPDH-F：5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′；GAPDH-R：5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGA-3′。

1.3 观察指标及评价标准

①比较健康组和AS患者组的外周血CDR1as的表达水平，采用公式2-ΔΔCt计算出两组样本中CDR1as相对表达量。②绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线，评估CDR1as对AS的诊断性能，包括灵敏度、特异度及截断水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；采用ROC曲线分析CDR1as的诊断性能，以P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDR1as在健康人群和AS患者中的表达

RT-qPCR结果显示，AS患者组外周血CDR1as表达水平为（0.993±0.165），低于健康组的（0.768±0.169），差异有统计学意义（t=4.258，P＜0.01，图1）。

图1 CDR1as在健康人和AS患者外周血中的表达差异

2.2 ROC曲线分析CDR1as对AS的诊断性能

通过ROC曲线对CDR1as作为AS诊断标志物的效率进行评估，结果显示，CDR1as的AUC为0.827，灵敏度和特异度分别为70%和85%（图2），通过计算约登指数求出CDR1as的截断水平为0.835。

图2 外周血CDR1as表达水平对AS诊断的ROC曲线

3 讨论

AS早期病变小，往往无症状隐匿发展，患者很难在此期间发觉不适并就诊，而它是多种心脑血管疾病的病理基础。因此，早期识别AS可以让患者得到及时治疗，改善预后。目前，影像学检查在AS斑块形成后的确定性诊断中灵敏度高、特异性强，但并不能提示斑块形成前的高危状态，不具有及时做出早期诊断的作用，因此发掘早期无创指标尤显重要。

circRNA是一种特殊类型的非编码RNA，不同于前体mRNA产生的线性RNA，circRNA不含5′端帽子结构和3′端多聚腺苷尾结构，它是通过反向剪接，由5′-3′磷酸二酯键连接形成的闭合环状结构的新型分子，不易被核酸外切酶降解，因此其具有高度稳定性，检测结果更为可靠[9]；同时，它能够稳定存在于人的多种体液中，如唾液、血液和外泌体，可以通过无创的方式收集并检测[10]；此外，它还具有进化保守性和组织特异性[11]，这显示出其作为生物标志物的优势。

circRNA与AS关系十分密切。已有研究表明[12]，circHIPK3可通过靶向miR-190b/ATG7信号通路激活细胞自噬，减少氧化型低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞内的脂质含量，对AS脂质代谢具有一定意义；circANRIL可通过控制rRNA成熟，阻止核糖体的生物发生以及活化p53基因，起到抗AS的作用[13]。一项基于临床的研究显示[14]，以AS为基础的冠心病患者中共有624个circRNA显著上调和171个circRNA显著下调，这提示AS的发生发展可能由多种circRNA共同参与。

以往对于CDR1as的研究主要集中于恶性肿瘤，且标本类型大多为肿瘤组织和细胞，在心血管疾病以及血液样本中的研究较少。例如，Li等[15]研究表明，与正常组织和细胞相比，在食管鳞癌组织和细胞系中CDR1as明显上调，CDR1as与肿瘤分期有关，并预测食管鳞癌患者的预后不良。另有研究发现[16]，检测外周血中的CDR1as水平对诊断类风湿性关节炎具有一定价值。鉴于此，本研究采集AS患者外周血标本进行检测，结果显示，AS患者组外周血CDR1as表达水平低于健康组，差异有统计学意义（P＜0.01）。这表明外周血中的CDR1as水平具有区分AS患者和健康人的能力，为无创诊断提供了可能性。此外，ROC曲线评估外周血CDR1as表达水平作为AS诊断标志物的能力的AUC为0.827（P＜0.05），灵敏度和特异度分别为70%和85%，以约登指数算得其截断水平为0.835，证明外周血CDR1as水平诊断AS的性能尚可，具有作为早期诊断AS的无创生物标志物的潜力。本研究的不足之处在于样本量较少，结果有待大样本量进行进一步的研究验证。

综上所述，本研究证明AS患者外周血中circRNA CDR1as表达水平明显低于健康人，对AS具有一定的诊断价值，这为其成为早期诊断AS的新型无创检查指标提供了一种可能性。