miR-424-5p/Rictor/mTORC信号轴诱导肝癌细胞自噬性死亡的机制

梁辉 杨金平 范银白

1.南昌大学第二附属医院肝胆胰腺外科，江西南昌330006；2.江西省赣州市立医院麻醉科，江西赣州341099；3.江西省赣州市人民医院体检科，江西赣州 341000

原发性肝癌简称肝癌，已跃居世界恶性肿瘤致死病因第2位[1]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物（mam malian target of rapamycin complex，mTOR）为相对保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，可调控细胞增殖、凋亡、自噬、迁移黏附、骨架调节等[2]，mTOR有mTORC1/2两种催化亚基形式存在，其中mTORC1对雷帕霉素敏感，而mTORC2对雷帕霉素不敏感[3]，Rictor在mTORC2所介导的肿瘤活化机制中扮演重要角色[4]。微RNA（microRNA，miRNA）可通过和下游靶基因的3′-非翻译区相结合，以调控细胞基因转录后水平，参与细胞存活率、凋亡及信号转导[5-6]。miR-424-5p为肝癌组织中低表达的新型miRNA，过表达后可抑制肝癌进展[7]。自噬是由溶酶体介导的降解途径，可降解细胞器内受损及冗余成分成小分子，供细胞再利用，对细胞内环境起维稳作用，如何诱导癌细胞自噬性死亡为肝癌治疗研究重点[8-9]。本文将研究miR-424-5p/Rictor/mTORC信号轴诱导肝癌细胞自噬性死亡的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肝癌细胞Hep-3B购自中国科学院上海细胞生物研究所。常规复苏肝癌细胞Hep-3B，细胞常规培养于Dulbecco′s改良培养基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）培养液，37℃，CO2浓度5%，隔天换液，细胞密度达50%～70%时更换为不含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI 1640培养基。

1.2 仪器与试剂

人肝癌细胞Hep-3B购自中国科学院上海细胞所；PBS缓冲液购自范德生物科技公司；miR-424-5p mimics、miR-424-5p inhibitors、Rictor过表达质粒、Rictor siRNA均购自上海吉玛制药技术有限公司；FBS购自美国Invitrogen公司；DMEM、RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司；100U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素购自北京Solarbio公司；转染用Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司；兔抗Lc3-Ⅱ抗体、兔抗Lc3-1抗体、兔抗Beclin1抗体、兔抗P62抗体购自Abcam公司；pmiR-REPORTTMLucifeRase系统购自美国Promega公司；DMSO购自美国Sigma公司；总RNA抽提试剂盒、Custom gene qRT-PCR定量试剂盒、逆转录试剂盒购自美国Fermentas有限公司；PCR引物购自上海生工公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；小鼠抗GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗、FITC标记的二抗及ECL化学发光检测试剂盒购自美国Santa Cruz公司。CO2恒温培养箱购自美国Forma Scientific公司；7900HT Real-time PCR仪购自美国ABI公司；倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，激光共聚焦显微镜购自无锡联发易创科技有限公司；CCK8试剂盒购自上海尚宝生物科技有限公司；FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司；超低温冰箱购自日本Sanyo公司；双报告基因检测分析仪购自美国Promega公司。

1.3 分组及方法

取1×106个处于对数生长期的Hep-3B细胞，种植于6孔板中。①对照组：PBS；②过表达miR-424-5p组：转染miR-424-5p mimics；③干扰miR-424-5p表达组：转染miR-424-5p inhibitor；④过表达Rictor组：转染Rictor过表达质粒；⑤干扰Rictor表达组：转染Rictor siRNA。

1.4 观察指标

1.4.1 细胞活性CCK-8实验检测细胞活性，描绘细胞生长曲线。

1.4.2 细胞凋亡及细胞周期收集转染48 h后的各组细胞，800 r/min离心10 min，离心半径10 cm，乙醇固定，PBS洗涤，加1 g/L核糖核酸酶200 μl，37℃孵育30 min，加入PI染液1 ml，4℃避光放置30 min后予以流式细胞仪检测。

1.4.3 自噬情况①透射电镜法观察切片自噬体形成，采用激光共聚焦显微镜分别在488、587 nm激发波长下观察自噬小体、自噬溶酶体形成；②RT-PCR、Western blot检测细胞Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ、Beclin1、P62 mRNA和蛋白表达水平。

1.4.4 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/蛋白激酶B/mTORC1信号轴激活情况①RT-PCR测定miR-424-5p/Rictor/mTORC2/蛋白激酶B（protein kinases B，Akt）/mTORC1信号轴关键分子mRNA表达水平；②采用Western blot法检测Rictor、mTORC2、Akt、mTORC1蛋白表达。

1.4.5 miR-424-5p与Rictor靶向关系验证以肝癌细胞Hep-3B基因组DNA为模板，利用荧光素酶活性实验验证miR-424-5p与Rictor的靶向关系。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间行LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hep-3B细胞中miR-424-5p表达

miR-424-5p在Hep-3B细胞中低表达，表达量为（0.45±0.05），大小为307 bp（图1）。

图1 Hep-3B细胞中miR-424-5p表达

2.2 各组细胞凋亡、细胞活性、细胞周期的比较

过表达miR-424-5p组G0+G1期细胞比例高于对照组，而细胞活性低于对照组，干扰miR-424-5p表达组及过表达Rictor组G0+G1期细胞比例低于过表达miR-424-5p组，细胞活性高于过表达miR-424-5p组、干扰Rictor表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）。干扰miR-424-5p表达组、过表达Rictor组、干扰Rictor表达组的G0+G1期细胞比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。过表达miR-424-5p组细胞凋亡率高于对照组，干扰miR-424-5p表达组及过表达Rictor组细胞凋亡率低于过表达miR-424-5p组，干扰miR-424-5p表达组、过表达Rictor组干扰Rictor表达组的细胞凋亡率比较，无明显差异（图2～3，表1）。

图2 各组细胞凋亡情况

图3 各组细胞活性的比较

表1 各组细胞周期构成的比较（%，±s，n=10）

表1 各组细胞周期构成的比较（%，±s，n=10）

注G0、G1、S、G2、M为细胞周期；与对照组比较，aP＜0.05；与过表达miR-424-5p组比较，bP＜0.05

组别G0+G1SG2+M对照组过表达miR-424-5p组干扰miR-424-5p表达组过表达Rictor组干扰Rictor表达组F值P值47.15±4.86 64.32±6.57a 53.87±5.43b 50.18±5.23b 57.62±5.89ab 14.146＜0.001 25.53±2.62 23.88±2.47 19.46±1.98a 17.23±1.85ab 21.35±2.26ab 21.798＜0.001 27.96±2.85 11.02±1.24a 27.98±2.86b 32.76±3.35ab 31.42±3.25ab 96.839＜0.001

2.3 自噬小体、自噬溶酶体形成情况的比较

过表达miR-424-5p组在488、587 nm激发波长下发现自噬小体、自噬溶酶体，且多于对照组（图4）。

图4 自噬小体、自噬溶酶体形成情况的比较

2.4 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信号轴激活情况

过表达miR-424-5p组Rictor、mTORC2、Akt、mTORC1的mRNA表达水平低于干扰miR-424-5p表达组及过表达Rictor组，高于干扰Rictor表达组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。干扰miR-424-5p表达组、过表达Rictor组、干扰Rictor表达组的Rictor水平均高于对照组，干扰miR-424-5p表达组、过表达Rictor组的mTORC2、Akt、mTORC1表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。干扰miR-424-5p表达组、过表达Rictor组、干扰Rictor表达组的Rictor、mTORC2、Akt、mTORC1表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2～3，图5～6）。

图5 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信号轴mRNA表达水平（n=10）

表2 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信号轴mRNA表达水平的比较（±s，n=10）

表2 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信号轴mRNA表达水平的比较（±s，n=10）

注与对照组比较，aP＜0.05；与过表达miR-424-5p组比较，bP＜0.05；mTORC2：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2；Akt：蛋白激酶B；mTORC1：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1

组别RictormTORC2AktmTORC1对照组过表达miR-424-5p组干扰miR-424-5p表达组过表达Rictor组干扰Rictor表达组F值P值0.26±0.03 0.37±0.04a 0.48±0.05ab 0.59±0.06ab 0.32±0.04ab 84.951＜0.001 0.31±0.04 0.38±0.04a 0.52±0.05ab 0.63±0.07ab 0.34±0.04 74.713＜0.001 0.22±0.03 0.29±0.03a 0.42±0.04ab 0.58±0.06ab 0.25±0.03 139.684＜0.001 0.36±0.07 0.45±0.05a 0.56±0.06ab 0.72±0.08ab 0.41±0.04 54.079＜0.001

2.5 各组自噬标志蛋白表达水平的比较

过表达miR-424-5p组Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ、Beclin1表达水平最低，P62表达水平最高。过表达miR-424-5p组Lc3-Ⅱ、Beclin1水平低于对照组，P62水平高于对照组，干扰miR-424-5p组仅Lc3-Ⅱ高于对照组，过表达Rictor组Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ、Beclin1高于对照组，干扰Rictor组Lc3-Ⅱ水平低于对照组，而P62水平高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；干扰miR-424-5p表达组、过表达Rictor组的Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ水平高于过表达miR-424-5p组，干扰miR-424-5p表达组、过表达Rictor组、干扰Rictor表达组的Beclin1高于过表达miR-424-5p组，而P62低于过表达miR-424-5p组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；干扰miR-424-5p表达组、过表达Rictor组、干扰Rictor表达组的Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ、Beclin1、P62比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表3 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信号轴蛋白表达水平的比较（±s，n=10）

表3 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信号轴蛋白表达水平的比较（±s，n=10）

注与对照组比较，aP＜0.05；与过表达miR-424-5p组比较，bP＜0.05；mTORC2：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2；Akt：蛋白激酶B；mTORC1：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1

组别RictormTORC2AktmTORC1对照组过表达miR-424-5p组干扰miR-424-5p表达组过表达Rictor组干扰Rictor表达组F值P值0.16±0.02 0.29±0.03a 0.45±0.03ab 0.56±0.07ab 0.22±0.04ab 157.644＜0.001 0.25±0.02 0.41±0.05ab 0.49±0.05ab 0.58±0.06ab 0.34±0.03ab 82.980＜0.001 0.31±0.04 0.38±0.04a 0.46±0.05ab 0.58±0.06ab 0.32±0.04ab 57.798＜0.001 0.26±0.03 0.36±0.03a 0.46±0.05ab 0.52±0.06ab 0.33±0.04a 56.737＜0.001

表4 各组自噬标志蛋白表达水平的比较（±s，n=10）

表4 各组自噬标志蛋白表达水平的比较（±s，n=10）

注与对照组比较，aP＜0.05；与过表达miR-424-5p组比较，bP＜0.05

组别Lc3-ⅡLc3-ⅠBeclin1P62对照组过表达miR-424-5p组干扰miR-424-5p表达组过表达Rictor组干扰Rictor表达组F值P值0.20±0.02 0.14±0.02a 0.26±0.03ab 0.34±0.03ab 0.16±0.02a 110.001＜0.001 0.14±0.02 0.11±0.02 0.15±0.03b 0.21±0.03ab 0.13±0.04 16.905＜0.001 0.25±0.03 0.16±0.02a 0.28±0.03b 0.35±0.03ab 0.27±0.03b 58.375＜0.001 0.18±0.02 0.38±0.04a 0.21±0.03b 0.16±0.03b 0.33±0.04ab 87.685＜0.001

图6 miR-424-5p/Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1信号轴蛋白表达水平（n=10）

2.6 双荧光素酶报告基因实验结果

miR-424-5p对Rictor的表达有直接抑制作用，Western blot结果显示，对照组、过表达miR-424-5p组、干扰miR-424-5p组的Rictor相对表达水平比较，差异有统计学意义（F=27.727，P＜0.05）；过表达miR-424-5p组Rictor相对表达水平低于对照组、干扰miR-424-5p组，干扰miR-424-5p组Rictor相对表达水平高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图7～8）。

图7 双荧光素酶报告基因实验结果（n=10）

3 讨论

miRNA表达或功能异常介导肝癌发生发展[10-11]，miR-424-5p作为新型miRNA其抑癌作用在胃癌、胰腺癌等中已被证实[12-13]。但关于miR-424-5p的抑癌机制仍未完全明确。自噬自身水平决定了肿瘤细胞最终命运，温和而轻微的保护性自噬可促进细胞存活，而激烈或长时间的致死性自噬可能导致细胞自噬性死亡[14]。叶明等[15]发现，核内胞质性自噬体可导致肝癌细胞、肝细胞特殊性核溶解与细胞死亡，但目前miR-424-5p是否可诱导肝癌细胞自噬研究较少。

本研究发现，过表达miR-424-5p会诱导肝癌细胞Hep-3B发生凋亡、G0+G1期占比较高、细胞活性低，而低表达miR-424-5p可能促进肝癌细胞Hep-3B发生增殖、G0+G1期比例高、细胞凋亡减少，提高细胞活性。miR-424-5p过表达可抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡，而miR-424-5p低表达发挥相反作用[16]。也有研究[17]发现，miR-424-5p可抑制ICC细胞侵袭转移能力，抑制其肿瘤细胞的上皮-间质转化。

图8 干扰miR-424-5p组、过表达miR-424-5p组、对照组的Western blot结果

前期研究发现，mTORCl/2双重抑制剂OSI-027可同时下调mTORCl和mTORC2底物磷酸化，雷帕霉素处理或沉默mTORCl基因会导致Akt（Ser473）磷酸化水平上调，此外mTORC2在维持肝癌细胞生物学特性方面具有重要作用，且其激活与Akt途径活化有关。当前有学者认为Rictor是定义mTORC2的核心成分[18-19]。Rictor可直接影响mTORC2组装，使改变mTORC2活性，调控Akt（Ser473）磷酸化，影响细胞增殖、分化[20-21]。自噬有助于应对缺氧、饥饿等刺激下细胞存活。在自噬信号网络中，Rictor参与mTORC2组装，mTORC2可调控Akt（Ser473）磷酸化，Akt再通过激活下游mTORC1途径，最终调控细胞自噬。本研究结果表明，miR-424-5p可通过靶向Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1发挥抑癌作用，同时miR-424-5p可直接抑制Rictor的表达，与既往研究[22-23]相似。

Beclin1属于编码调节自噬的蛋白质，在自噬中起核心作用[24-25]，而Lc3-Ⅱ、Lc3-Ⅰ为自噬小体膜上标记蛋白，P62则是Lc3-Ⅱ底物，可和Lc3-Ⅱ组成复合物，最终被自噬溶酶体降解[26]。本研究表明miR-424-5p可调节自噬水平而抑制肝癌细胞自噬，最终影响其发生发展。

综上所述，miR-424-5p可通过调控Rictor/mTORC2/Akt/mTORC1表达影响自噬，从而抑制肝癌细胞增殖，促进其凋亡。但这一机制仅为miR-424-5p的一个作用方面，关于其在肝癌细胞中的其他作用机制仍有待进一步研究。