饲粮中添加枯草芽孢代谢物对肉鸡生长性能及肠道健康的影响

李文娅， 彭 展， 郭柑彤， 何 涛， 刘扬科， 吴金梅

（1.中农颖泰林州生物科园有限公司，河南 林州 456550；2.河南牧业经济学院动物医药学院，河南 郑州 450046）

抗生素在畜牧养殖中不仅用于治疗疾病，而且用于预防，并作为促生长剂广泛使用，导致耐药菌及残留的抗生素通过肉类摄入和处理传播给人类，食品安全问题成为社会关注的焦点（Tiseo等，2020）。2021年12月农业农村部颁布《“十四五”全国畜牧兽医行业发展规划》，明确提出加快研发推广抗生素替代品的重点任务，因此，开发新型饲料添加剂替代饲用抗生素成为研究热点。

抗菌肽（AMPs）是一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽物质，因具有热稳定性高、水溶性好、相对分子质量小且不易产生耐药性等优点逐步成为抗生素替代品的选择之一。自1980年瑞典科学家G.Boman等在天蚕蛹体内发现抗菌多肽并命名为天蚕素后，人们相继从细菌、真菌、动植物乃至人体中均发现并分离获得具有抗菌活性的多肽，其中已有70多种抗菌多肽的结构被测定（甄阳光，2018；尚田田等，2013）。目前已知抗菌肽的作用机制与细胞膜的结构和性质密切相关，因AMPs带正电荷，而细菌细胞膜上的LTA、TA、LPS及LPG带负电荷，二者以静电作用相互结合，然后AMPs的疏水端嵌入细菌磷脂双分子层中，扰乱细菌双分子层中脂质和蛋白质等组分原有的排列顺序，形成“桶板”“地毯”和“环形孔”等模型的跨膜通道，最终导致细菌胞内物质外漏而死亡（甄阳光，2018；Chan等，2006）。而宿主正常细胞是真核细胞，其主要由鞘磷脂、中性磷脂和胆固醇等不带电荷的物质组成，而且磷脂双分子层更加稳固，不易形成膜通道，因此不能与带正电荷的AMPs结合（Findlay等，2010）。这也说明了AMPs作为饲料添加剂的安全性。吴东（2020）等研究表明，在饲粮中添加不同比例的抗菌肽对肉鸡的生长性能及肠道菌群等指标都有一定程度的改善。郭森（2016）等研究表明，抗菌肽在饲粮中使用能显著增加爱拔益加（AA）肉鸡的生长性能、改善肠道菌群等。

本试验中枯草芽孢杆菌代谢物是由枯草芽孢杆菌YT168-6表达的含有37个氨基酸残基的抗菌肽，故命名为枯草三十七肽。抗菌肽不仅结构稳定，而且对高温、酸碱、胃蛋白酶、胰蛋白酶具有良好的抵抗力（Garcia等，2014）。但关于抗菌肽对肉鸡肠道健康的报道甚少，因此本试验在饲粮中添加枯草芽孢代谢物，研究其对肉鸡生长性能、肠道组织形态及盲肠微生物多样性的影响，从而为指导饲料企业使用最优的无抗方案提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 枯草芽孢代谢物（枯草三十七肽）由中农颖泰林州生物科园有限公司提供。枯草芽孢杆菌活菌数≥2.0×1010cfu/g，为市场购买。

1.2 试验设计 选取1日龄体重相近[（37.10±0.10）g]的快大型白羽肉鸡612只，随机分为3个处理组，每组6个重复，每个重复34羽肉鸡。对照组（CG）在基础饲粮中添加200 g/t枯草芽孢杆菌，试验组1（EG1）、试验组2（EG2）分别在基础饲粮中添加150、200 g/t枯草芽孢代谢物（枯草三十七肽）。采用玉米-豆粕型基础饲粮，其组成参照《鸡饲养标准》（NY/T33-2004）配制，具体原料组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 饲养管理 本试验在辽宁省鞍山市海城市某肉鸡养殖小区进行，采用三层立体笼养，每笼饲养17只鸡。饲养过程中安排专人负责，温湿度、光照、通风、免疫、消毒等按照试验场常规管理进行，药物预防与治疗均按照试验场要求进行。试验期间，进行健康观察，做好记录，试验期42 d。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能指标测定 在试验开始和结束时称量并记录各处理组肉鸡的体重，统计试验期内各组肉鸡的采食量，计算出栏均重、平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料肉比（FCR）及欧洲效益指数（EPI）。

1.4.2 肠道组织形态学观察 在42 d时，从每个重复抽取1只体重相近的肉鸡，处死解剖后，剪取3~5 cm的空肠、回肠和盲肠肠段，放入10%中性福尔马林溶液充分固定后，横向采集样品管腔结构约0.5 cm长的组织放入包埋盒中继续固定24 h。将固定完全的组织进行脱水透明、浸蜡包埋、切片烤片后，用苏木精-伊红（H&E）染色法染色，晾干后的切片置于Motic数字切片扫描仪下进行扫描拼接，生成一张全视野的数字化切片后，使用软件DSAssistant Lite进行组织学观察，选择合适的物镜倍数采集图片，再使用软件Motic Images Plus 3.0分别测量每张图片中的肠道绒毛高度和隐窝深度，测量时每个样品选取3个视野，每个视野内至少3个数据，并计算肠绒毛高度与隐窝深度的比值（V/C）。

1.4.3 盲肠微生物指标测定 在42 d时，从每个重复抽取1只体重相近的肉鸡，处死后迅速解剖，分离出盲肠，立即在无菌条件下将其内食糜取出放入无菌离心管，液氮保存。

1.4.3.1 DNA提取和16S rRNA测序 将盲肠内容物用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]按照说明书进行总基因组DNA的提取，再用酶标仪进行浓度检测，用1.8%的琼脂糖对其完整性进行电泳检测。用V338F和V806R通用引物对基因组总DNA的16S rRNA的V3~V4区域进行PCR扩增，扩增产物用1.8%琼脂凝胶电泳检测，混匀后用Monarch DNA Gel Extraction（北京鸿跃创新科技有限公司）进行纯化回收，使用TruePrepRDNA Library Prep Kit V2（南京诺唯赞生物科技有限公司）进行文库构建，建好的文库通过Qseq-400方法进行质检，质检合格的文库用Illumina Novaseq 6000进行测序。

1.4.3.2 测序结果处理及分析 基于Illumina Novaseq测序平台，构建以双末端测序的方法对小片段文库进行测序。通过对Reads拼接过滤，聚类或去噪，丰度分析及物种注释等操作，从而揭示样品物种的构成。再进行α多样性分析、β多样性分析等，从而挖掘样品之间的差异。

1.5 数据统计分析 用Excel 2019对试验数据进行初步整理，采用SPSS 25.0软件对试验结果进行方差分析，方差分析用one-way ANOVA进行，组间多重比较用Duncan’s法进行。试验结果以“平均值±标准误”表示，P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 各处理对肉鸡生长性能的影响 由表2可知，EG1的出栏均重和ADG与CG之间没有显著差异（P>0.05）；EG2的出栏均重和ADG显著高于CG（P<0.05）。3组之间ADFI和FCR差异不显著（P>0.05）。CG和EG1的EPI无显著差异（P>0.05），且均显著低于EG2（P<0.05）。

表2 各处理对肉鸡生长性能的影响

2.2 各处理对肉鸡肠道组织形态的影响 由表3可以看出，与CG相比，EG1和EG2的空肠绒毛高度显著提高（P<0.05），回肠和盲肠的绒毛高度无显著性差异（P>0.05），空肠、回肠和盲肠的隐窝深度差异不显著（P>0.05）。EG1的空肠、回肠和盲肠V/C与CG相比，均有不同程度的提高，分别提高了17.01%、9.69%和59.19%（P>0.05）；EG2的空肠V/C显著高于CG（P<0.05），回肠和盲肠分别提高了18.64%和55.14%（P>0.05）。

表3 各处理对肉鸡肠道组织形态的影响

2.3 各处理对肉鸡盲肠微生物组成及多样性的影响

2.3.1 门水平 从图1可以看出，42 d肉鸡盲肠微生物门水平相对丰度前10位的微生物，以厚壁菌门（Firmicutes）为主，其次分别为拟杆菌门（Bacteroidetes）、变 形 菌 门（Proteobacteria）、蓝 藻 菌 门（Cyanobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、放线菌门 （Actinobacteria）等，均以Firmicutes和Bacteroidetes为优势菌门，占总数的80%以上。

图1 42 d肉鸡门水平上前10位盲肠微生物相对丰度柱形图

2.3.2 科水平 由图2可以看出，42 d肉鸡盲肠微生物科水平相对丰度前15位的微生物，包含了瘤胃球菌科 （Ruminococcaceae）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、理 研 菌 科（Rikenellaceae）、苜蓿 科（Christensenellaceae）、乳 酸 细 菌 科（Lactobacillaceae）、 梭 菌 目 （Clostridiales_vadinBB60_group）、未分类嗜气性胃腺杆菌目（uncultured_bacterium_o_Gastranaerophilales）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和拟杆菌科（Bacteroidaceae）等。与CG相比，EG1和EG2的Ruminococcaceae和Lachnospiraceae相对丰度均明显增加，且EG1和EG2的盲肠微生物在科水平上的分布更相似。

图2 42 d肉鸡科水平上前15位盲肠微生物相对丰度柱形图

2.3.3 属水平 从图3可以看出，42 d肉鸡盲肠微生物属水平相对丰度前25位的微生物，其中主要是瘤胃球菌科（Ruminococcaceae_UCG-014）、鞘脂单胞菌属（Subdoligranulum）、未分类毛螺菌科 （uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae）、拟杆菌属（Alistipes）、苜蓿科（Christensenellaceae_R-7_group）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）等，占群落总数的85%以上。与CG相比，EG1的Ruminococcaceae_UCG -014、Subdoligranulum、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和Eubacterium coprostanoligenes group的相对丰度增加，Alistipes和uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae相对丰 度 降 低，EG2的Subdoligranulum、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和Eubacterium coprostanoligenes group相对丰度增加，Lactobacillus和Faecalibacterium相 对 丰 度 降 低。EG1和EG2对 比 得 出，EG1中Ruminococcaceae_UCG-014，Christensenellaceae_R-7_group和Lactobacillus相对丰度高于EG2，而Subdoligranulum和Alistipes的相对丰度相反。

图3 42 d肉鸡属水平上前30位盲肠微生物相对丰度柱形图

2.3.4 α多样性 由表4可以看出，三个处理组42 d肉 鸡 盲 肠 微 生 物 的ACE、Chao1、Simpson、Shannon指数统计数据，展示了CG和EG的α多样性结果。其中，前两个指标衡量物种丰度，后两个指标衡量物种多样性（Grice等，2009）。结果显示，各组肉鸡的ACE、Chao1指数差异不显著（P>0.05），说明三组物种丰度差异不显著，三组的Shannon指数差异不显著（P>0.05），而EG1的Simpson指数显著高于CG（P<0.05），EG2与其他两组无显著性差异（P>0.05），说明EG1的物种多样性显著高于CG，而EG2与CG物种多样性差异不显著。

表4 各处理的42 d肉鸡盲肠微生物α多样性分析

2.3.5 β多样性 图4是42 d肉鸡盲肠微生物的PCoA聚类圈分析图，属于β多样性指标之一，用来研究样本群落组成的相似性或相异性（Wang等，2012）。从图中可以看出，三个处理组的微生物群落有部分相似，且EG1和EG2的物种组成和群落结构相似度更高。

图4 样品PCoA聚类圈分析图

3 讨论

3.1 枯草三十七肽对肉鸡生长性能的影响 生长性能是畜禽养殖中重要的指标之一，不仅与经济价值有密切关系，而且是相关添加剂是否能替代抗生素的评价指标。欧洲效益指数（EPI）是一个综合评价生长性能的指标，跟肉鸡体重、成活率、料肉比及出栏日龄均有联系，指数越大，说明盈利越高。研究表明，抗菌肽有提高动物生长性能的作用。孙全友（2014）等研究表明，饲粮中添加200 g/t抗菌肽能显著降低肉鸡料肉比，显著提高体重。苗旭（2020）等试验结果也表明，饲粮中添加抗菌肽能提高肉鸡生长性能，降低腹泻率。本试验结果显示，饲粮中添加枯草三十七肽能显著提高出栏均重、ADG和EPI，提高肉鸡生长性能，与上述报道结果一致。

3.2 枯草三十七肽对肉鸡肠道组织形态的影响肠道形态可以衡量机体肠道的健康状况（Csernus等，2020），其绒毛高度直接决定机体对营养物质的吸收能力，隐窝深度反映细胞生成率，隐窝深度增加则提示肠道对于营养物质的吸收能力减弱。绒毛高度/隐窝深度（V/C）则综合反映了肠道功能状态，比值上升，表示黏膜改善，吸收能力增强，动物生长加快（Chamorro等，2019）。张凯瑛（2021）在饲粮中添加300 mg/kg或500 mg/kg抗菌肽，结果显著提高了42 d肉鸡小肠各肠段绒毛高度，显著降低回肠的隐窝深度，显著提高了空肠和回肠的V/C。王建（2019）等研究结果显示，饲粮中添加抗菌肽Api-PR19能显著提高21 d肉鸡的空肠和42 d十二指肠的绒毛高度和V/C。本试验结果表明，饲粮中添加枯草三十七肽能显著提高空肠绒毛高度和V/C，对回肠和盲肠的绒毛高度和V/C也有不同程度的提高。这一结果说明饲粮中添加枯草三十七肽在一定程度上改善了肉鸡肠道形态的发育，从而促进肉鸡健康生长。

3.3 枯草三十七肽对肉鸡盲肠微生物组成及多样性的影响 肠道微生物菌群的平衡能够保证畜禽的健康生长，尤其是畜禽的盲肠内存在大量微生物，与畜禽的免疫、消化吸收等有着密切的联系。研究表明，益生菌和抗菌肽均可抑制有害菌，增加有益菌数量，改善肠道微生物环境（易中华等，2005）。白建（2014）等研究表明，抗菌肽降低了盲肠内大肠杆菌的数量，增加了乳酸菌的数量，且与海藻粉存在协同效应。研究显示，肉鸡门水平的优势菌群是Firmicutes和Bacteroidetes，占微生物群落总数的80%以上，其在能量的产生和代谢中起着重要作用（Pandit等，2018；Oakley等，2014）。在本研究中，试验组和两个对照组的肉鸡盲肠微生物在门水平上的相对丰度没有显著差异，群落的优势菌门是Firmicutes，与报道一致。在本研究中，与对照组相比，试验组的Ruminococcaceae和Lachnospiraceae相对丰度明显升高，二者含有产短链脂肪酸（SCFAs）的科，SCFAs抑制肠道致病菌生长繁殖的方式是通过影响肠道酸碱度，从而为肉鸡良好的生长性能提供了前提，其中，Ruminococcaceae可能与试验组肉鸡平均日增重的提高有关（Zeng等，2019；Nava等，2011）。试验组的Blautia相对丰度高于对照组，Blautia能降解不同类型的碳酸化合物，产生乙酸、乳酸等代谢产物，其含量的增加与宿主肠道健康有关（Abaidullah等，2019；Yang等，2016；Liu等，2008）。

肠道微生物多样性影响动物消化吸收，常用α多样性和β多样性表示。其中，α多样性反映的是单个样品物种丰度及物种多样性（Grice等，2009），β多样性比较不同样品在物种多样性方面存在的相似程度，可通过多种指标反映，PCoA分析是一种非约束性的数据降维分析方法，可用来研究样本群落组成的相似性或相异性（Gower等，1966）。本试验结果显示，饲粮中添加枯草三十七肽能显著提高盲肠α多样性的物种多样性，与朱随亮（2021）等研究结果一致。

4 结论

饲粮中添加枯草三十七肽可显著增加肉鸡出栏均重、平均日增重和欧洲效益指数，提高肠道绒毛高度和绒隐比，改善盲肠微生物多样性，增强肉鸡的消化吸收能力，从而提高肉鸡的生长性能，改善肠道健康。