在校大学生UCP1基因-3826 A>G位点多态性与体质指数的相关性分析

刘永新，陈 艳，李启艳，王雨晴，来明名

（大理大学基础医学院，云南 大理 671000）

肥胖已成为全球范围内常见的医学社会问题，肥胖会导致许多疾病的患病风险升高，如高血压、2型糖尿病、心脑血管疾病等〔1-2〕。遗传学认为肥胖是基因和环境因素共同作用的结果。大量研究表明，大约65%的肥胖是可遗传的，参与能量消耗或能量摄取的基因可能与肥胖的发生密切相关〔3-4〕。

解偶联蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）是一种位于线粒体内膜的H+转运蛋白，能够将H+运送至线粒体基质，使氧化磷酸化解偶联不产生三磷酸腺苷，而是转化为热能释放出去〔5〕。UCP1在具有产热功能的棕色脂肪组织（brown adipose tissue，BAT）中特异性高表达，主要功能是参与BAT的产热调节来维持机体的能量代谢平衡〔6〕。在寒冷、肾上腺素或甲状腺素等刺激下，BAT中的UCP1基因表达增加，从而刺激脂肪组织消耗更多能量来产生热量。功能研究〔7〕发现，UCP1基因多态性能够影响UCP1 mRNA表达水平，从而调控能量代谢平衡。UCP1基因-3826 A>G位于上游启动子区，这个位点的突变与肥胖和代谢紊乱相关联。-3826 A>G位点突变可导致线粒体氧化磷酸化水平降低，从而引起组织三酰甘油水平增加，高密度脂蛋白水平降低，低密度脂蛋白和胆固醇水平增加〔8〕。但在瑞典和西班牙人中开展的研究则未发现上述关联〔9-10〕。这种差异可能是由于不同人群的基因背景不同、基因的连锁不平衡或人群所处的环境不同所导致的。因此，该位点与肥胖之间的相关性仍需要在不同人群中加以验证。

体质指数（body mass index，BMI）是利用体质量和身高来衡量人的胖瘦程度的一个重要指标。流行病学研究发现，BMI增高与肥胖、高血压、糖尿病、代谢综合征等疾病的发生密切相关〔11-12〕。因此，将BMI控制在正常范围内，有助于对肥胖及其相关代谢综合征的预防。BMI易受外界因素的影响，如生活习惯、饮食习惯等，但遗传因素对BMI的影响尚不太清楚。本研究以大理大学在校大学生为研究对象，通过计算个体BMI，检测UCP1基因-3826 A>G位点多态性，探讨该位点多态性与BMI的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验样本界定及采集从NCBI数据库中查得UCP1基因-3826 A>G（rs1800592）位点平均突变率为33%，根据现况研究中有限总体的样本量计算公式〔13〕：n1=z2α/2（1-P）P/δ2，n2=n1N/（N+n1），式中，P=33%为UCP1基因-3826 A>G位点G突变率，δ=5%为允许误差，zα/2=1.96（α=0.05双侧），N=3 000为研究总体人群数量，计算得调查所需最小样本量n2=305，最终共收集308例样本。随机选取2019年3月—2020年12月大理大学308例在校大学生作为研究对象，采集其口腔黏膜细胞。样本采集前，告知受试者采样目的，征得受试者本人知情同意后进行样本采集并登记其姓名、年龄、身高、体质量及联系方式。研究遵循的程序符合大理大学医学伦理委员会制定的伦理学标准并得到批准。

1.2 主要试剂和仪器DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号：DP304）；Master Mix（LGC公司，批号：13116560）；超微量核酸蛋白浓度测定仪（Thermo公司）；高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；实时荧光定量PCR仪（ABI公司）。

1.3 基因组DNA提取清水漱口清理口腔后，用消毒棉签在受试者口腔内壁刮取黏膜细胞，将取样棉签放入装有500 μL 0.9%氯化钠溶液的1.5 mL离心管中，振荡混匀，10 000 r/min离心1 min，获得口腔黏膜细胞沉淀，使用基因组DNA提取试剂盒，提取基因组DNA。

1.4 UCP1基因-3826 A>G位点多态性分型检测采用竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）对所提取DNA样本进行基因分型检测。根据UCP1基因SNP位点rs1800592（-3826 A>G）设计3条KASP标记引物，包括2条正向特异性引物和1条反向通用引物，引物序列：正向引物（A）：GAAAATGTAGAACACATTAACAAA TGCACTT；正向引物（G）：AAAATGTAGAACACATT AACAAATGCACTC；反向引物：AGCGATTTCTGATT GACCACAGTTTGAT。反应体系10 μL，包括4.78 μL DNA（20～50 ng/μL），5 μL 2×KASP Master Mix，0.14 μL KASP Assay Mix，0.08 μL Mg2+。KASP Assay Mix由3条引物稀释获得，按正向引物（A）（100 μmol/L）∶正向引物（G）（100 μmol/L）∶反向引物（100 μmol/L）∶重蒸水=12∶12∶30∶46混合而成。采用降落PCR进行扩增，反应程序：94℃热处理15 min；94℃变性20 s，61~55℃退火和延伸60 s，10个降落循环（每个循环降低0.6℃）；94℃变性20 s，55℃退火和延伸60 s，26个循环；4℃避光保存。PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，每次反应设置1个空白对照组，其DNA模板用重蒸水代替，扩增结束后进行基因分型分析。

1.5 BMI计算及分组测量受试者身高、体质量，计算BMI，BMI=体质量（kg）/身高（m）2。根据BMI，将样本分为体质量过轻（BMI<18.5 kg/m2）、体质量正常（18.5 kg/m2≤BMI<24.0 kg/m2）、体质量过重（24.0 kg/m2≤BMI<28.0 kg/m2）和肥胖（BMI≥28.0 kg/m2）4组。

1.6 统计分析采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析；计数资料以［n（%）］表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCP1基因-3826 A>G位点多态性分布情况利用KASP技术对UCP1基因-3826 A>G位点多态性进行基因分型检测，结果见图1。随机抽取30份样本进行一代（Sanger）测序，对KASP检测结果进行验证，显示2种方法的基因分型结果完全一致。见图2。AA基因型（野生型）64例（占20.8%），AG基因型（杂合变异型）216例（占70.1%），GG基因型（纯合变异型）28例（占9.1%），AA、AG和GG基因型频率分别为：0.21，0.70和0.09。其中，正常A基因频率为0.56，突变G基因频率为0.44。

2.2 UCP1基因-3826 A>G位点多态性与不同性别的相关性分析在308例受试者中，年龄18~21岁，男性96例（占31.2%），女性212例（占68.8%），不同性别受试者各基因型构成比差异无统计学意义。见表1。

表1 不同性别受试者3种基因型构成比［n（%）］

2.3 UCP1基因-3826 A>G位点多态性与BMI的相关性分析308例受试者中体质量过轻、体质量正常、体质量过重和肥胖人数所占比例分别为16.9%、79.2%、3.9%和0.0%，其中肥胖人数为0。经统计分析发现，与野生型AA携带者BMI（19.60±2.05）kg/m2相比，AG和GG基因型携带者BMI分别为（20.52±1.77）kg/m2和（20.95±2.69）kg/m2，显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。对体质量过轻组、体质量正常组和体质量过重组基因型频率和等位基因频率进行比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中，纯合变异型GG基因型频率和突变G等位基因频率在体质量过重组所占比例高于体质量过轻组和体质量正常组。见表2。风险评估显示，与体质量正常组相比，体质量过重组GG基因型会使体质量增加的风险增高3.875倍，且差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。以上结果表明，BMI较低者UCP1基因突变的频率较低，而BMI较高者UCP1基因突变的频率也较高，UCP1基因多态性与BMI存在一定的关联性，且GG基因型会使体质量增加的风险提高。

表2 UCP1-3826 A>G位点基因型频率和等位基因频率在不同人群中的分布［n（%）］

表3 体质量正常组和体质量过重组不同基因型风险评估［n（%）］

3 讨论

本研究随机抽取大理大学在校大学生为研究对象，提取口腔黏膜脱落细胞基因组DNA，通过KASP技术对UCP1基因-3826 A>G位点多态性进行基因分型。研究发现，随着BMI的增高该位点的突变频率也逐渐增高，且纯合变异型GG会使体质量增加的风险增高3.875倍。结果提示，UCP1基因-3826 A>G位点多态性与BMI、肥胖具有一定的相关性。

UCP1主要位于BAT线粒体内膜上，参与机体的产热调节和能量代谢，具有抵制肥胖发生的作用〔14〕。因此，UCP1基因表达水平不同会对人体的能量代谢产生重大影响，而肥胖的本质正是由机体能量摄入与消耗的不平衡导致的。Jorge等〔15〕研究发现，UCP1基因突变可以导致脂肪组织UCP1的mRNA表达水平下降，使肥胖的发生风险增加。Sun等〔16〕研究发现，UCP1基因-3826 A>G位点突变会使中国东北汉族人群原发性高血压的患病风险增加。本研究发现，UCP1基因-3826 A>G位点多态性与体质量、BMI之间存在相关性，纯合变异基因型GG在体质量过重组所占比例明显高于体质量过轻组和体质量正常组，并且突变等位基因G的出现频率随着BMI的增加而增高。由于BMI是评价人胖瘦的重要指标之一，本研究结果提示UCP1基因-3826 A>G位点多态性可能会导致肥胖的发生，与Jorge等〔15〕的研究结果类似。有研究〔17-18〕发现，UCP1基因启动子区域还存在其他位点多态性与疾病易感性相关，例如-1766 A>G和-112 A>C。Kim等〔17〕研究发现，-1766 A>G位点多态性与韩国人群体脂积累有关，突变基因型AG和GG的腰臀比、体脂质量、体脂比例均显著高于AA型。Fukuyama等〔18〕研究发现，-112 A>C位点突变会引起胰岛素抵抗，增加日本人群对2型糖尿病的易感性。然而，这些位点是否会通过相互作用影响疾病的发生目前仍然不是很清楚，这也将是以后研究的一个重点。

本次研究对象为在校大学生，年龄偏小且都是健康人群，在样本统计时发现，体质量正常的人群所占比例明显高于体质量过轻或过重人群，肥胖人群在此次随机选取的样本中没有发现，可能会对统计结果有一定的影响。后续将继续扩大样本量或选取不同年龄段的人群进一步进行研究，阐明UCP1基因-3826 A>G位点多态性与肥胖之间的关系，有助于人们更深入了解肥胖的发病机制，探索增加能量消耗的减肥新方法，使UCP1成为潜在的重要药物靶点。