无茎黄芪根的化学成分生物活性研究

陈颖志，张伟，2，陈浩，单华，杨艺玲，姜北，2*

（1.大理大学药学院，云南 大理 671000；2.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室，云南 大理 671000）

黄芪属（Astragalus）系豆科（Leguminosae），植物种类繁多，仅我国就有400余种〔1〕，部分作为传统中药材，有多种药用功效，其中最为常见的是中药材正品黄芪，植物基原为膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根〔2〕。云南滇西北地区黄芪属植物资源十分丰富，有各类黄芪属植物近50种，但无正品黄芪自然分布〔3〕。近年来课题组对云南黄芪属植物进行了大量的研究，发现云南黄芪属植物化学成分复杂多样，多数都与正品黄芪有较大差异，仅有梭果黄芪等少数黄芪属植物在主要化学成分方面与正品黄芪具有一定的相似性〔4〕。

无茎黄芪（Astragalus acaulis）为黄芪属华黄芪亚属短缩茎黄芪组植物，主要分布于海拔4 000 m左右的滇西北草坡及石缝中，根生用可利水消肿，炙用可补中益气，用于脾虚泄泻，内伤劳怠〔5〕，其化学成分、药理活性迄今均无文献报道。课题组前期研究已从无茎黄芪根甲醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇部位分离纯化得到19个化合物〔6〕，其化学成分与正品黄芪有较大差异，并不具备替代正品黄芪的物质基础。为深入认识无茎黄芪的生物活性与药用价值，本实验对无茎黄芪根提取物及主要化学成分抗氧化与镇痛活性进行了研究，为黄芪属植物的开发利用提供基础性实验依据。

1 实验仪器与材料

1.1 实验仪器AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；小鼠独立通气笼（苏州市苏杭科技器材有限公司）；Varisoskan LUX多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；Master-S30UVF纯水机（上海和泰仪器有限公司）。

1.2 实验材料96孔组织培养板（NEST Biotech Co.Ltd）；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH，Aldrich Chem.Co.USA，批号：D21，140-0）；阿司匹林肠溶片（沈阳奥吉娜药业有限公司，批号：国药准字H20065051）；二甲基亚砜（天津化学试剂有限公司，批号：20070905）；维生素C（上海化学试剂分装厂，批号：84-01-10）；冰醋酸（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20150922）。

无茎黄芪根的总提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及分离纯化得到的甘草素（1）、异甘草素（2）、isomucronvlatol（3）、丁香脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷（4）、落叶松脂醇（5）、落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷（6）、5-甲氧基落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷（7）、对羟基苯甲醛（8）、山梨醇（9）、7β-羟基谷甾醇（10）、β-sitosteryl-D-glucoside-6'-palmitate（11）来自课题组前期研究工作〔6〕。

1.3 实验动物SPF级昆明种小鼠，体质量18~22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCKY（湘）2011-0004。动物饲养于独立通气笼中，控制环境温度（20±1）℃和相对湿度（60±5）%，标准颗粒饲料喂养。

2 实验方法

2.1 小鼠镇痛实验

2.1.1 醋酸致扭体实验 取42只昆明种小鼠，按体质量和性别随机分为7组：对照组，总提物组，阿司匹林组，化合物4、5、6、7组，每组6只，雌雄各半〔7〕。各组小鼠适应性喂养1周后，进行药物干预〔8〕。药物均以0.9%氯化钠溶液溶解，总提物组及化合物组灌胃给予100 mg/kg剂量的相应供试样品；依据文献〔7-9〕中使用剂量，阿司匹林组灌胃给予200 mg/kg阿司匹林溶液；对照组小鼠灌胃给予等体积的0.9%氯化钠溶液，给药体积为0.2 mL/10 g〔9〕。各组小鼠在给药1 h后，分别腹腔注射0.6%的醋酸溶液（现用现配），注射体积为0.1 mL/10 g，记录下腹腔注射后15 min内各组小鼠的扭体反应次数，并依据下列公式计算扭体抑制率，以评价无茎黄芪根的化学成分对醋酸致小鼠疼痛的影响〔10-11〕。扭体抑制率（%）=［（对照组扭体次数-给药组扭体次数）/对照组扭体次数］×100%。

2.1.2 小鼠热水甩尾实验 取42只昆明种小鼠，随机分为对照组，阿司匹林组，总提物组，化合物4、5、6、7组，每组6只，雌雄各半。按照“2.1.1”项下的剂量对各组小鼠灌胃给予相应的供试样品，各组小鼠在给药前和给药结束后60 min，分别以50℃热水浸烫鼠尾2 cm，记录鼠尾浸入水到甩出水的时间间隔，计算并分析小鼠对热水的痛阈值的变化〔12〕。

2.2 体外抗氧化活性实验参照文献〔13〕中DPPH自由基清除实验方法，对无茎黄芪根的总提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及11个单体化合物进行抗氧化活性测试。

2.3 统计分析采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据用（±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 小鼠镇痛实验结果

3.1.1 无茎黄芪根的化学成分对醋酸致小鼠扭体的影响 无茎黄芪根的化学成分对醋酸致小鼠扭体的影响情况见表1。实验结果显示，对照组在15 min内的平均扭体次数为39.6次。阿司匹林组和化合物组有明显的扭体抑制率；无茎黄芪根的总提物和4个单体化合物均有一定的镇痛活性，其中化合物7较为显著，对小鼠扭体抑制率高达78.8%。供试样品的活性大小：化合物7＞总提物＞化合物5＞化合物4＞化合物6。

表1 无茎黄芪根的总提物及部分单体化合物对醋酸致小鼠扭体反应的影响（±s，n=6）

表1 无茎黄芪根的总提物及部分单体化合物对醋酸致小鼠扭体反应的影响（±s，n=6）

注：与对照组比较*P<0.05。

组别 剂量/（mg/kg） 扭体次数 扭体抑制率/%对照组 — 39.6±3.3 —阿司匹林组 200 总提物组 100 23.8±3.5* 40.3 18.8±4.7* 52.5化合物4组 100 23.0±4.2* 42.0化合物5组 100 20.8±3.9* 47.5化合物6组 100 29.0±14.8 26.8化合物7组 100 8.4±1.6* 78.8

3.1.2无茎黄芪根的化学成分对小鼠热水甩尾的影响 无茎黄芪根的化学成分对小鼠热水甩尾的影响情况见表2。实验结果显示，给药后60 min与给药前相比，对照组、阿司匹林组和总提物组小鼠的热水甩尾平均痛阈值无明显变化；化合物4、7组小鼠的热水甩尾平均痛阈值分别提升1.84、1.25 s；化合物5、6组小鼠的热水甩尾平均痛阈值分别下降0.93、0.89 s，表明化合物4、7具有一定的镇痛活性，活性大小：化合物4＞化合物7。

表2 无茎黄芪根的总提物及部分单体化合物对小鼠热水甩尾反应的影响（±s，n=6）

表2 无茎黄芪根的总提物及部分单体化合物对小鼠热水甩尾反应的影响（±s，n=6）

热水甩尾痛阈值/s给药前 给药后60 min对照组 — 5.31±0.67 5.75±0.75阿司匹林组 200 6.30±1.25 5.80±1.11总提物组 100 4.50±0.83 4.67±0.31化合物4组 100 2.56±1.06 4.40±0.40化合物5组 100 3.81±1.03 2.88±0.99化合物6组 100 3.75±1.26 2.86±1.43化合物7组 100 3.50±1.07 4.75±1.41组别 剂量/（mg/kg）

3.2 体外抗氧化活性实验结果无茎黄芪根的化学成分的抗氧化活性测试结果见表3。实验结果表明，无茎黄芪根的总提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位在5个浓度下（250.0 μg/mL为最高浓度，依次倍半稀释）均有抗氧化活性，对DPPH的清除率呈一定的线性关系。其中抗氧化活性：乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞总提物。11个受试化合物中有5个化合物和1组混合物对DPPH有不同程度的清除能力；化合物6和7抗氧化活性显著，清除DPPH的平均IC50值分别为38.40、36.53 μg/mL。

表3 无茎黄芪根的总提物、萃取部位及单体化合物抗氧化活性测试结果（±s，n=3）

注：NS表示未计算出相应IC50值。

不同浓度（μg/mL）样品对DPPH的清除率/%IC50/（μg/mL）250.0 125.0 62.5 31.3 15.6维生素C 91.37±0.07 86.82±0.00 86.15±0.01 86.08±0.00 85.19±0.00 9.17总提物 84.37±0.14 45.89±0.01 12.16±0.01 5.17±0.01 3.23±0.02 137.22乙酸乙酯部位 84.74±0.13 66.50±0.02 26.53±0.01 7.40±0.00 2.11±0.01 93.89正丁醇部位 77.22±0.20 67.70±0.01 18.64±0.02 1.52±0.01 -1.38±0.00 97.35化合物1 52.23±0.41 20.78±0.00 4.50±0.01 6.65±0.00 17.00±0.00 NS化合物2 56.45±0.38 34.94±0.01 35.39±0.00 32.33±0.00 28.67±0.02 NS化合物3和8 55.93±0.38 31.96±0.02 30.03±0.01 25.27±0.01 21.47±0.01 272.11化合物4 55.57±0.38 32.80±0.01 28.14±0.01 20.83±0.01 13.36±0.01 233.86化合物5 58.21±0.36 32.40±0.01 30.25±0.01 28.17±0.01 26.31±0.00 267.47化合物6 84.55±0.13 67.25±0.00 54.47±0.01 44.85±0.01 38.12±0.01 38.40化合物7 85.66±0.12 70.18±0.00 58.28±0.01 45.52±0.01 36.49±0.01 36.53化合物9 39.48±0.52 3.34±0.01 1.59±0.00 1.82±0.01 0.00±0.00 NS化合物10 56.45±0.38 32.41±0.00 27.65±0.01 18.86±0.01 0.63±0.01 197.39化合物11 56.46±0.37 34.13±0.01 28.96±0.00 21.63±0.01 4.78±0.01 198.48样品名称

4 讨论

无茎黄芪成分复杂多样，涉及黄酮、木脂素、酚性成分、三萜、甾体、脂肪酸、多元醇等多种类型。在本研究进行的醋酸致小鼠扭体、热水甩尾和抗氧化实验中，无茎黄芪根的提取物以及部分化合物均展现出较好的生物活性，特别是木脂素类化合物7，同时具有显著的镇痛和抗氧化生物活性，提示无茎黄芪根在镇痛、抗氧化（抗衰老）方面的潜在药用价值，可为无茎黄芪的开发利用提供实验依据。