紫地榆防龋牙膏对牛切牙早期釉质龋的生物矿化作用

徐 磊，李秋艳，王丽梅，蓝 海*

（1.大理大学药学院，云南 大理 671000；2.大理白族自治州人民医院口腔科，云南 大理 671000）

牙膏作为很多龋齿患者的首选护理产品，既有美容功效又有医用功效，在清洁牙齿的同时还可以清新口气，并抵抗龋齿的进程和细菌斑块的积聚〔1〕。目前市场上的消炎牙膏长期使用易导致口腔菌群失调〔2〕，天然中草药产品因其价廉且不良反应较少而广受消费者欢迎〔3〕。本研究将紫地榆提取物不同部位添加到牙膏基质中，观察其对主要口腔致龋菌生长的抑制作用，评估含紫地榆提取物不同部位的牙膏对釉质龋的抵抗力及再矿化能力〔4〕。

1 材料与仪器

紫地榆，购于大理药材市场，经大理大学药学院生药学教研室杨月娥高级实验师鉴定为紫地榆Geranium strictipes R.Kunth的干燥根；变形链球菌（Streptococcus mutans）ATCC25175、黏 性 放 线 菌（Actinomyces viscosus）ATCC27044购自广东微生物菌种保藏中心；新鲜牛切牙购自大理市泰兴市场；人工唾液（ISO/TR10271，中性，上海源叶生物科技有限公司）；脱矿液（2.2 mmol/L氯化钙，2.2 mmol/L磷酸二氢钾，0.05 mmol/L乙酸，pH=4.5）。

ZQX-1402MCD自动转塔数显显微维氏硬度计（依工测试测量仪器上海有限公司）；S-3400N扫描电子显微镜（SEM，日立高新技术公司）；体视显微镜（重庆光学仪器厂）。

2 方法

2.1 紫地榆有效部位的制备称取紫地榆粗粉2 kg，置于4 L 95%乙醇中，在50℃下回流提取6次，2 h/次，抽滤，使用旋转蒸发仪将滤液旋蒸成浸膏后加适量蒸馏水溶解，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂萃取。舍去石油醚部位，其余部位提取物置于冷冻干燥机制得冻干粉备用〔5〕。乙酸乙酯部位得粉末230 g，正丁醇部位得粉末190 g。

2.2 紫地榆防龋牙膏制备紫地榆防龋牙膏配方：羧甲基纤维素钠（CMC）0.5 g，角叉莱胶0.8 g，甘油15.0 g，山梨醇8.0 g，乙酸乙酯部位/正丁醇部位4.0 g，二水合磷酸氢钙42.0 g，水合硅石3.0 g，薄荷油1.0 g，十二烷基硫酸钠（SDS）2.2 g，尼泊金乙酯0.1 g，尼泊金丙酯0.05 g，低聚异麦芽糖（IMO）0.4 g，加水至100 g。制备过程：称取增稠剂（CMC和角叉莱胶），加入甘油和70%山梨醇搅拌，调节温度75~85℃，使其均匀分散，再加入水溶液（IMO、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯预先分散于去离子水中），搅拌成溶胶状，陈化2 h；搅拌下加入磨擦剂（二水合磷酸氢钙、SDS），搅拌2 h；加入薄荷油及紫地榆提取物，搅拌陈化2 h即可〔6〕。

2.3 紫地榆防龋牙膏对致龋菌最低抑菌浓度（MIC）的测定

2.3.1 实验菌株复苏及菌液制备 在37℃、厌氧条件下TPY固体培养基培养48 h复苏菌种，于体视显微镜下观察无杂菌，在相同条件下培养18 h增菌，取菌液于低速离心机1 200 r/min离心2 min，取沉积菌加无菌0.9%氯化钠溶液，使用0.5麦氏比浊管调整菌液浓度为108CFU/mL〔7〕。

2.3.2 MIC的测定 将紫地榆乙酸乙酯部位牙膏、紫地榆正丁醇部位牙膏和空白牙膏基质溶于TPY液体培养基，用二倍稀释法调整药液浓度为16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL，每个培养基中加入配制的药液2 mL和菌液20 μL，在37℃厌氧条件下培养48 h，肉眼观察无菌落生长的药液浓度为MIC〔8〕。

2.4 牙釉质标本的制备将新鲜牛牙剔除软组织，洗净，选取无裂痕、龋损、氟斑的牙齿50颗，用切割机切掉牙根，超声洗涤40 min，用磨抛机将牙釉质打磨至釉质面呈镜面状为宜，在其表面开窗4 mm×4 mm，蒸馏水洗净并晾干备用。

2.5 牙釉质硬度的测量

2.5.1 脱矿 将上述牙釉质浸泡在脱矿液中，置于37℃的恒温培养箱中10 d，每5天换1次脱矿液〔9〕。

2.5.2 再矿化 将脱矿后的牙釉质样本冲洗并吹干，随机分成5组（n=10），分别为空白牙膏基质组、乙酸乙酯部位牙膏组、正丁醇部位牙膏组、NaF牙膏组和去离子水组。其中前4组分别取空白牙膏基质、乙酸乙酯部位牙膏、正丁醇部位牙膏、NaF牙膏各25 g，加40 mL去离子水，搅拌至匀浆，将4组牙釉质标本浸泡于牙膏浆保持3 min，取出后再浸于37℃人工唾液，间隔12 h重复1次该步骤，每天换液，重复12 d。去离子水组牙釉质标本不做任何处理，浸于37℃人工唾液，每天换液，重复12 d〔10〕。

2.5.3 牙釉质硬度测量 将“2.4”项中牙釉质标本置于镶嵌机中镶嵌，用显微硬度计在开窗区平面随机测量6个点的表面显微硬度值（SMH），每个点测5次，分别去掉1个最大值和1个最小值，得到的平均硬度值为基线硬度值〔11〕，记为SMH0。取出脱矿后的牙釉质，冲洗，吹干，按上述方法测量硬度值，记为SMH1；再矿化后的牙釉质，冲洗，吹干，用相同方法测量硬度值，记为SMH2。按下面公式计算表面显微硬度恢复率（SMHR）：

SMHR（%）=（SMH2-SMH1）/（SMH0-SMH1）×100%。

2.6 SEM观察牙釉质表面形貌随机抽取脱矿前、脱矿后和再矿化后的釉质标本，经2次真空干燥、喷金属铂观察各组釉质表面形态的变化。

2.7 统计分析采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用SNK-q检验，组内比较采用配对t检验（α=0.05），P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 紫地榆提取物不同部位牙膏抑菌作用结果抑菌实验结果显示紫地榆乙酸乙酯部位牙膏稀释液和紫地榆正丁醇部位牙膏稀释液对变形链球菌和黏性放线菌的MIC均为4.000 mg/mL。空白牙膏基质稀释液对变形链球菌和黏性放线菌无明显的抑菌作用。

3.2 硬度测量结果选取基线值SMH0差异无统计学意义（P>0.05）的牙釉质进行平行脱矿实验。各组脱矿后牙釉质硬度明显减小，与脱矿前的牙釉质硬度相比差异有统计学意义（P＜0.05）；再矿化后NaF牙膏组、乙酸乙酯部位牙膏组的硬度值明显恢复到脱矿前的硬度，且SMHR为：NaF牙膏组＞乙酸乙酯部位牙膏组＞正丁醇部位牙膏组＞空白牙膏基质组＞去离子水组，与去离子水组比较，乙酸乙酯部位牙膏组和正丁醇部位牙膏组的SMHR较高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组再矿化前后SMH比较（±s）

表1 各组再矿化前后SMH比较（±s）

注：与SMH0比较*P＜0.05；与SMH1比较#P＜0.05；与空白牙膏基质组比较△P＜0.05；与NaF牙膏组比较○P＜0.05；与去离子水组比较□P＜0.05。

组别 SMH0 SMH1 SMH2 SMHR/%空白牙膏基质乙酯部位牙组 350.70±15.81 270.07±16.85* 311.73±5.58*# 52±36.89○乙酸膏组 357.70±5.56 270.40±28.25* 355.23±8.90# 97±45.61△○□正丁醇部位牙膏组 356.50±13.06 273.97±17.89* 345.80±3.14# 87±40.45△○□NaF牙膏组 359.63±6.31 271.10±38.07* 400.40±14.90*# 146±60.87△□去离子水组 351.93±36.52 272.63±7.24* 298.93±8.83# 33±39.87○

3.3 SEM测量结果经空白牙膏基质稀释液处理后的牙釉质表面，结构较脱矿后和去离子水组致密，表面不平整，见图1A；经紫地榆乙酸乙酯部位牙膏稀释液和紫地榆正丁醇部位牙膏稀释液处理后的牙釉质表面无明显腔隙，致密，存在少量的沉淀物，见图1B~C；经NaF牙膏稀释液处理后的牙釉质表面存在大量球状沉积物，见图1D；去离子水组牙釉质表面凹凸不平，存在少量沉积物，见图1E；脱矿前牙釉质表面平整光滑无明显腔隙，而脱矿后牙釉质表面凹凸不平，存在鳞状凸起，表面疏松，见图1F～G。

4 讨论

龋病是一种慢性牙体硬组织进行性破坏性疾病，是人类最为常见的口腔疾病，通常与变形链球菌和黏性放线菌等主要致龋菌过度生长有关〔12〕。因此本实验选择变形链球菌和黏性放线菌这两种致龋菌作为实验菌。考虑本实验所制备的牙膏配方中含有薄荷油成分，可能具有协同抑菌作用，因此增加空白牙膏基质对口腔主要致龋菌的MIC测定实验，但并未检测出其协同抑菌作用。

牙釉质硬度在脱矿后下降，使用紫地榆提取物牙膏后牙釉质表面硬度有所提高，说明紫地榆提取物牙膏具有牙釉质再矿化的作用〔13〕。SEM图像结果显示，脱矿后牙釉质表面存在腔隙，结构疏松，空白牙膏基质组和去离子水组牙釉质表面也较致密并存在少量沉积物，可能是因为经过人工唾液处理后，产生磷酸钙沉积物附着于牙釉质表面，修复少量腔隙〔14〕。而紫地榆提取物牙膏组较空白牙膏基质组和去离子水组牙釉质表面更平整、更致密，说明紫地榆提取物能有效修复脱矿的牙釉质。NaF牙膏组是由于氟化物促进钙磷离子结合生成稳定的氟磷灰石，在表面大量沉积〔15〕。

综上所述，紫地榆提取物牙膏稀释液对两种致龋菌均有抑制作用，且对牙釉质具有促进再矿化的作用，证明中药紫地榆具有修复龋齿的效果。