美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制备及细胞毒性研究

高 冉，张维炜，吉春燕，刘光明，郭美仙，刘晓波

（大理大学药学院，云南 大理 671000）

在肿瘤治疗中，由于抗肿瘤药物半衰期较短、治疗周期长，对正常细胞有强烈的杀伤作用，常导致治疗失败，可采用靶向制剂将药物递送到肿瘤部位发挥药效〔1〕，从而提高患者的生存率。葡聚糖是一种水溶性的天然多糖，具有较好的稳定性、低免疫原性、良好的水溶性和生物相容性等特性，常作为高分子载体递送药物及蛋白质〔2〕，同时借助外加磁场作用或利用细胞特异性配体作为靶向基团，将药物递送至肿瘤组织，达到提高肿瘤靶区内药物浓度，减少毒副作用的效果，可用于临床诊断、免疫检测、肿瘤治疗和靶向给药〔3〕。前期研究〔4-7〕已证实，美洲大蠊提取物多肽具有较强的体内抗肿瘤活性，同时可改善免疫力低下小鼠的免疫功能，与化疗药物联合治疗H22荷瘤小鼠具有增效减毒作用。但蛋白多肽类药物分子量大、脂溶性差，与消化道生物膜的亲和力差，难以通过消化道的生物膜屏障，其口服生物利用度普遍较低〔8〕。本实验将美洲大蠊提取物多肽制成粒径≤5 μm的葡聚糖微粒，一方面可直接作为剂型存在，如干粉吸入剂，在空气中直接、高效地进入肺泡，作用于患部；另一方面可包封于聚合物微粒，既起到靶向的作用，又达到缓释的目的，最终减少用药量与给药次数，延长药物作用时间〔9〕。葡聚糖微粒作为载药系统时，会在体内与各种类型的细胞发生相互作用，在评价其应用前景时，检测其可能引发的毒副作用至关重要〔10〕。本研究通过体外毒性评价方法，检测美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒对HepG2和A549两株细胞的细胞毒性，评价美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的生物安全性，为进一步应用于干粉吸入剂或缓释微粒等剂型提供技术支持和实验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料美洲大蠊提取物多肽由大理大学何正春副教授提供；聚乙二醇（PEG）6000、葡聚糖（美国Sigma公司）；二氯甲烷（天津市福晨化学试剂厂）；MicroBCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有有限公司）；HepG2、A549细胞（中国科学院昆明动物所细胞库）；Annexin V-EGFP、碘化丙啶（碧云天生物技术有限公司）。

1.2 仪器ALPHA1-4LSC冷冻干燥机（德国CHRIST公司）；XW-80A旋涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；伯腾ELX808酶标仪（美国伯腾仪器）；RTCA实时无标记细胞分析仪（美国ABI公司）；冷场发射S4800扫描电子显微镜（SEM，日本日立公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。

2 方法

2.1 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制备方法及表征

2.1.1 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制备将美洲大蠊提取物多肽水溶液和葡聚糖溶液混匀，在0℃按一定比例将PEG6000溶液加入一起混匀搅拌1 min，形成乳液，立即置于-20℃冰箱预冻8~12 h。预冻好的样品放入事先开启的真空冷冻干燥机（待温度降到-80℃）冻干24 h。用二氯甲烷洗涤冻干的粉末，并用旋涡混合器旋涡5 min使PEG6000充分溶解，16 000 r/min离心5 min，待葡聚糖颗粒全部沉淀，去上清液，重复3~5次。将除去PEG6000的样品在通风橱自然挥干12~24 h，制得美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒〔11〕。

2.1.2 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的载药量、包封率和质量回收率测定 精密称取10.0 mg美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒，于4℃用一定量的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解。配制蛋白标准溶液：将30.0 mg牛血清白蛋白（BSA）标准品溶解于1.2 mL蛋白标准配制液中，制成浓度为25.0 mg/mL的蛋白标准液，充分溶解混匀，取适量25.0 mg/mL蛋白标准液，稀释至终浓度为0.5 mg/mL。制作蛋白标准曲线：取0、1、2、4、8、12、16、20 μL的0.5 mg/mL蛋白标准液加入到标记好的96孔板中，每孔分别加20、19、18、16、12、8、4、0 μL的PBS使各孔体积为20 μL，形 成 终 浓 度 为0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/mL的标准品。配制待测样品：取各组待测样品5 μL，加入PBS 15 μL，使总体积为20 μL。配制BCA工作液：计算样品数量，将BCA试剂A与BCA试剂B按体积比50∶1配 制BCA工作液，即用即配。每个样品加入100 μL BCA工作液，轻拍96孔板混匀，于37℃温箱中孵育30 min。计算待测样品总蛋白浓度：孵育结束后，于酶标仪上测定562 nm波长处的吸光度，据标准曲线计算蛋白浓度，然后用MicroBCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。按下列公式计算载药量、包封率和质量回收率：

2.1.3 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒制备条件的优化 在美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制备过程中，以PEG6000的含量、葡聚糖的含量以及美洲大蠊提取物多肽水溶液的配比3个因素进行单因素考察，以载药量作为主要的考察指标进行筛选。首先以不同浓度的PEG6000溶液（5%、10%、20%）与葡聚糖溶液（5%、10%、20%）按1∶1的体积比混匀，考察是否呈乳液状，如呈乳液状则按PEG6000溶液∶葡聚糖溶液∶美洲大蠊提取物多肽水溶液不同体积比（1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20）制备美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒（参照“2.1.1”项下美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制备），最后以载药量和包封率选出最优的实验条件〔12〕。

2.1.4 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的显微镜和SEM图像 取10.0 mg冻干好的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒放到2.0 mL的EP管里，滴加1.0 mL二氯甲烷并旋涡或超声使美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒分散均匀，吸取0.2~0.5 mL混悬液，滴到载玻片上使美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒分散开，待二氯甲烷挥发干，用显微镜进行观察、拍照。将所制备的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒样品均匀地平铺在粘有导电胶的铝片上，喷金后在SEM下观察其微观结构，作电镜图像。

2.2 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒细胞毒性的研究

2.2.1 实时无标记细胞分析（RTCA）法检测细胞毒性 为了检测美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒对细胞增殖的影响和细胞毒性，采用RTCA法对细胞进行动态监测，计算细胞增殖率。取对数生长期的HepG2细胞和A549细胞接种在E-plate板上，细胞密度为5×103个/孔，在细胞培养箱中培养24 h后，将美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒和完全培养基混合至所需的最终浓度（0.000、0.016、0.032、0.064、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL），以15 min的间隔监测给药后24、48、72 h的动态细胞指数（CI），计算细胞存活率〔13-14〕。

2.2.2 流式细胞术检测细胞活性 取对数生长期的HepG2细胞接种于6孔板中，每孔加入2.0 mL细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/孔。置于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h后，采用细胞培养液配制美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒细胞培养液悬液，浓度依次为0.008、0.016、0.032、0.064、0.125 mg/mL，同时配制空白的葡聚糖微粒细胞培养液悬液分别加入到对应的细胞孔内，每个浓度设3个复孔，另设3个阴性对照孔。每孔2.0 mL葡聚糖微粒细胞培养液悬液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h后，取出6孔板，每孔加入500 μL胰蛋白酶消化细胞，终止消化后，用移液枪反复吹吸混匀细胞，充分保证其为单细胞状态，收集至离心管，1 500 r/min离心3 min，用冰冷的PBS洗涤上述细胞2次，1 500 r/min离心3 min，再用500 μL PBS重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，在避光条件下加入10 μL Annexin V-EGFP混匀后，加入5 μL碘化丙啶混匀，室温避光反应15 min，1 h内用流式细胞仪进行观察和检测〔15-16〕。

2.3 统计分析采用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的载药量、包封率以不同浓度的PEG6000溶液（5%、10%、20%）与葡聚糖溶液（5%、10%、20%）按体积比1∶1混合后，10% PEG6000溶液和5%葡聚糖溶液，10%PEG6000溶液和10%葡聚糖溶液，20% PEG6000溶液和5%葡聚糖溶液混合后均呈乳液状，此时PEG6000富集相包裹着分散的葡聚糖富集相液滴，得到白色乳液，20% PEG6000溶液和10%葡聚糖溶液混合后则出现分层。20% PEG6000溶液、10%葡聚糖溶液和美洲大蠊提取物多肽水溶液按不同体积比（1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20）制备美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒，用MicroBCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量，按公式计算载药量分别为10.30%、28.25%、15.50%。体积比为1∶1∶10时载药量相对较高，可选用此体积比进行后续实验。后采用10% PEG6000溶液、5%葡聚糖溶液和美洲大蠊提取物多肽水溶液，以及10% PEG6000溶液、10%葡聚糖溶液和美洲大蠊提取物多肽水溶液按体积比1∶1∶10制备美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒，并计算载药量分别为86.70%、73.20%，包封率分别为66.70%，53.70%。由此选出后续实验条件：用10%PEG6000溶液、5%葡聚糖溶液和美洲大蠊提取物多肽水溶液按体积比1∶1∶10制备美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒。

3.2 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒基本表征在通风橱自然挥干的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒呈疏松状，分散性较好。显微镜下观察，粒径1~5 μm；SEM下观察，美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒排列整齐，大小无明显差异。见图1~2。

3.3 RTCA法检测细胞毒性在相同浓度的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒处理下，A549细胞较HepG2细胞更敏感。给药24 h时，美洲大蠊提取物

3.4 流式细胞术检测细胞存活率对细胞进行FITC/PI染色，经流式细胞术检测统计不同状态下细胞存活数量，间接反映对细胞的毒性影响。以HepG2细胞作为细胞模型，进行美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的细胞毒性检测实验，在各个浓度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL）下的HepG2细胞存活率分别为97.76%、86.44%、87.20%、83.48%、83.23%，表明美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒对HepG2细胞无明显细胞毒性。见图5。

4 讨论

细胞的代谢繁殖活性是细胞毒性检测中最重要的参数，被广泛用于药物体外毒性评价研究。本实验运用RTCA实时无标记细胞分析仪对细胞进行动态监测，RTCA法与传统的检测方法相比具有明显的优势，如操作简单、步骤少，具有完整的细胞效应图谱，同时提供大量、重要的动态反应信息，特别适用于肿瘤药敏实验。本研究结果显示，美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒对HepG2细胞未表现出显著毒性。对HepG2细胞未表现出显著生长抑制，但对A549细胞有一定的抑制作用，且呈剂量、时间依赖关系，这与国内报道的美洲大蠊提取物抑制肿瘤细胞增殖情况〔17〕一致。给药24 h后时，HepG2细胞的存活率达到90%以上，这主要是由于美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒具有缓释性，短时间内药物不易从载体中释放出来，故抑制作用相对较弱，但多肽葡聚糖微粒浓度达到1 000 μm/mL时对HepG2细胞无显著毒性作用，细胞存活率仍然高达90%以上。见图3~4。随时间的延长，药物释放量逐步增加，抑制效果会逐渐显现。用流式细胞仪进一步检测美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒对HepG2细胞活性的影响，结果表明美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒对HepG2细胞活性无显著影响。微粒虽对细胞生长无明显的抑制作用，但由于其缓释作用，随着时间的延长，药效发挥可诱导细胞凋亡，药物作用逐渐明显。为后续研究美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的药代动力学、毒性试验、体内靶向性抑制肝癌细胞生长及诱导癌细胞凋亡提供一定的理论基础和参考依据。

蛋白多肽类药物口服生物利用度普遍较低〔18〕，未来可将载药微粒制成静脉注射的微球制剂，一方面可以延长血液循环周期，另一方面微球制剂可穿透组织中的小毛细血管，最终在靶器官得到有效分布。本研究结果显示，制备的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒圆整均一，平均粒径约为5 μm，相关研究表明可用小于5 μm的固体蛋白微球作为固相，用m-S/O/W法制备微球〔19〕。接下来课题组将根据m-S/O/W法用以上实验制备的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒，包封于与生物相容可降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料中，制备成载药葡聚糖微球用于肿瘤的靶向治疗。另外，干粉吸入剂在肺部给药剂型的微粒尺寸需在1~5 μm〔20〕。本研究中低温诱导相分离法制备的微粒可满足上述2种剂型的要求，所以该微粒可能可以通过2种给药途径进行给药，为临床应用提供更多选择，具有广泛的应用前景。