赖氨酰氧化酶家族蛋白质与胃癌相关性的研究进展

熊 伟，李 彬，王播勇，刘如爱，姜 北，自加吉，周静华*

（1.大理大学基础医学院，云南 大理 671000；2.云南省高校临床生物化学重点实验室，云南 大理 671000；3.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室，云南 大理 671000）

胃癌是严重威胁人类健康和生命的消化系统恶性肿瘤之一，其病死率在全球范围内排恶性肿瘤致死率的第3位〔1〕。虽然近年来胃癌的临床诊疗得到了迅速发展，但术后患者的预后非常差。由于肿瘤侵袭和转移，晚期胃癌患者的5年生存率远低于10%〔2〕。因此，有必要了解胃癌发生发展的调控机制，以确定有效的临床治疗靶点。目前，越来越多的研究表明，赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）家族蛋白质在多种恶性肿瘤发生发展过程中发挥调控作用，但其在胃癌中的具体作用及分子机制尚不完全清楚。本文就LOX家族各个成员与胃癌发生和发展的相关性作一综述，以期发现可用于胃癌治疗的LOX家族蛋白质成员的特异性抑制剂。

1 LOX家族蛋白质的概述

LOX家族蛋白质是一类分泌型铜依赖性胺氧化酶，具有催化弹性蛋白和胶原蛋白在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）共价交联的作用。LOX催化ECM弹性蛋白和胶原蛋白中赖氨酸和羟赖氨酸残基的氧化脱氨基反应，产物形成分子间和分子内交联，这种分子间缩合将弹性蛋白或胶原蛋白的可溶性单体转化为ECM中的不可溶性纤维，并能抵抗非特异性蛋白水解酶所引起的弹性蛋白分解和胶原溶解，从而起到稳定ECM的作用〔3-4〕。人类有4种LOX同工酶，与LOX具有部分结构同源性，即赖氨酰氧化酶样蛋白1~4（lysyl oxidase like 1~4，LOXL1~4），这5个成员共同构成LOX蛋白家族〔5〕。人类LOX家族蛋白的编码基因分别定位于5、15、8、2和10号染色体上〔6〕。其中，LOX基因编码的mRNA开放阅读框最短，编码417个氨基酸，而LOXL2基因编码的mRNA开放阅读框最长，编码774个氨基酸〔7〕。LOXL1~4蛋白分别与LOX蛋白具有85%、58%、65%和62%的同源性。见表1。LOX家族成员都具有催化活性。5个家族成员的C端区域具有95%的同源性，由高度保守的205个氨基酸组成，该催化区域包括铜结合位点、赖氨酸酪氨酰基醌残基和细胞因子受体样结构域〔8〕，对它们的生物活性至关重要。然而，这些家族成员的N端序列却是多样性的，LOX和LOXL1蛋白含有前结构域，LOXL2~LOXL4蛋白各自含有4个富含半胱氨酸结构域的清道夫受体，这可能决定它们的亚细胞定位或介导蛋白质-蛋白质相互作用〔9-10〕。

LOX家族蛋白质的表达具有高度组织特异性。LOX蛋白在胎盘、睾丸、心脏、肺、肾脏和子宫中高表达，而在肝脏和大脑中只有很低的表达〔11〕；LOXL1蛋白在胚胎、肌肉、肾脏、心脏、肺和胰脏中高表达，但在肝脏和大脑中的表达也相对较低〔11〕；LOXL2蛋白在胎盘和子宫等组织中的表达很高，在肝脏和大脑中的表达也很低〔12〕；LOXL3蛋白在睾丸、脾脏、前列腺中高表达，在胚胎中的表达居中，在肝脏中几乎不表达〔13-14〕；LOXL4蛋白是整个蛋白家族在肝脏中唯一高表达的成员〔15〕。见表1。

2 LOX及LOXL1~4蛋白与胃癌发生发展的相关性

2.1 LOX蛋白与胃癌发生发展的相关性胃癌是发展中国家中发病率较高的消化系统恶性肿瘤之一〔16〕。在胃癌组织中检测到LOX基因mRNA的表达水平显著高于邻近的正常胃组织，并且与肿瘤浸润深度、淋巴结状态和T、N、M分期有关〔17〕。Kasashima等〔18〕发现胃癌细胞和组织中的LOX基因mRNA和蛋白质在缺氧条件下的表达水平显著高于常氧条件下的表达水平。此外，LOX蛋白的表达水平与胃癌患者的浸润深度、肿瘤分化、淋巴结转移、淋巴浸润、静脉浸润、腹膜转移等具有显著相关性，提示LOX基因高表达的胃癌患者预后不良〔19〕。LOX蛋白与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在胃癌不同进展期中的表达呈正相关，因此可以推测两者在胃癌浸润和转移的过程中具有相互协同作用，可能是由于VEGF的异常表达，引起ECM出现异常，进而导致LOX蛋白的异常表达〔20〕。通过siRNA靶向和调低LOX基因能够抑制缺氧诱导的胃癌细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并降低缺氧条件下胃癌细胞的迁移能力〔18〕。同样，Peng等〔19〕研究表明，与肿瘤周围的组织相比，LOX蛋白在胃癌组织中的表达水平也呈现上升的趋势，并且与浆膜浸润、远处和淋巴结转移以及晚期胃癌有关。此外，局部区域复发患者的LOX蛋白表达水平高于远处复发患者。考虑到LOX蛋白与基质硬度之间的关系，研究〔20〕显示巨噬细胞密度、微血管密度、微血管成熟、基质金属蛋白酶-9表达水平和Ⅳ型胶原表达水平在过表达LOX基因后均显著地升高，表明LOX蛋白激活了癌细胞并促进了胃癌的发展。将LOX蛋白与肿瘤标志物癌胚抗原、糖类抗原19-9、糖类抗原125和糖类抗原724结合可以显著提高预测胃癌淋巴结转移和腹膜转移的敏感性〔21〕。然而，一项研究〔22〕表明，由于人类胃癌组织中的DNA甲基化和杂合性丧失，LOX基因表达下调，并且LOX蛋白对胃癌发挥了抑制作用。因此，需要进一步探索LOX蛋白在胃癌发生发展中的作用。

2.2 LOXL1蛋白与胃癌发生发展的相关性LOXL1反义RNA1（LOXL1-AS1）基因位于人类染色体15q24.1上，由10 781个核苷酸和5个外显子组成。Sun等〔23〕的研究揭示，LOXL1-AS1基因在胃癌组织和细胞中高度表达，LOXL1-AS1蛋白的上调可预测胃癌患者的预后不良，其研究结果表明，LOXL1-AS1基因通过诱导细胞增殖、迁移、EMT和退分化加速胃癌的恶化。LOXL1-AS1基因在体内也能促进胃癌细胞生长与增殖。在功能上，LOXL1-AS1基因作为内源竞争RNA通过分泌miR-708-5p上调转录因子USF1。此外，该研究还证实LOXL1-AS1/miR-708-5p/USF1通路在胃癌进展中起促进作用，USF1促进了干细胞标记SOX2的转录。

有研究〔24〕显示，LOXL1基因在胃癌细胞中呈高表达，并且与胃癌预后差显著相关。基因集富集分析显示，LOXL1基因表达与参与EMT过程的基因表达呈正相关。与普通胃癌患者的肿瘤组织和细胞相比，LOXL1基因在腹膜扩散胃癌患者的肿瘤组织和细胞中过表达。LOXL1基因过表达降低E-钙黏蛋白（CDH1）表达，增加VIM、CDH2、SNAI2和PLS3蛋白的表达，进而促进胃癌细胞的迁移能力。而且过表达LOXL1蛋白的胃癌细胞将它们的形态改变为纺锤状形式。此外，LOXL1基因mRNA高表达与低分化的组织学类型、淋巴结转移密切相关，并且是一个预后不良的独立危险因素〔24〕。还有研究〔25〕表明，LOXL1基因的表达水平在不同临床病理学特征之间存在差异，在T分期较晚的胃癌患者中，LOXL1基因呈更高的表达水平。LOXL1蛋白可以通过WNT/β-catenin/cyclinD1信号通路促进胃癌细胞的增殖，但并不影响胃癌细胞的侵袭和迁移。以上研究结果提示，LOXL1蛋白在胃癌中主要发挥促癌作用。

2.3 LOXL2蛋白与胃癌发生发展的相关性Zhou等〔26〕在胃癌基质细胞中观察到LOXL2基因的过表达。基质细胞中LOXL2基因的表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、淋巴浸润、静脉浸润和腹膜播散显著相关。多因素回归分析显示，基质细胞中LOXL2基因的表达水平可能是胃癌患者总体生存率的独立预测指标。来自基质成纤维细胞的LOXL2蛋白也促进胃癌细胞的迁移。更重要的是，LOXL2基因高表达是胃癌患者预后不良的指标〔27〕。与正常上皮组织相比，LOXL2基因在原发癌组织中的表达显著升高，并且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移显著相关，预示着胃癌患者的总体预后较差。此外，在与原发性胃癌相关的转移淋巴结中也检测到LOXL2基因的表达。shRNA诱导的LOXL2基因沉默和抗LOXL2抗体降低了胃癌细胞的侵袭、黏附和转移能力。相反，LOXL2基因过表达促进了胃癌细胞的侵袭和黏附。此外，分泌型的LOXL2蛋白通过激活Src/FAK通路促进了胃癌细胞的侵袭和转移〔28〕。这些发现共同表明，LOXL2蛋白在胃癌中发挥促癌作用。

2.4 LOXL3蛋白与胃癌发生发展的相关性最近对LOXL3蛋白的研究〔29〕发现，除了作为胺氧化酶外，LOXL3蛋白还发挥着各种新的作用。LOXL3蛋白通过与SNAIL（一种参与EMT过程的转录因子）发生相互作用，在抑制CDH1基因表达中发挥作用。LOXL3蛋白与核周膜中SNAIL蛋白的相互作用能协同下调CDH1蛋白的表达，从而表明LOXL3蛋白参与肿瘤进展和转移。此外，SNAIL蛋白Ser11位点的磷酸化受蛋白激酶D1（protein kinase D1，PKD1）调节，PKD1促进LOXL3蛋白的上调及其与SNAIL蛋白的相互作用〔30〕。SNAIL蛋白Ser11位点的磷酸化导致与组蛋白脱乙酰酶1和2（HDAC1和HDAC2）以及LOXL3蛋白结合。磷酸化的SNAIL蛋白与HDAC1和HDAC2形成的复合物在细胞核中稳定，并促进肿瘤增殖标记物的上调，如细胞周期蛋白D1和AJUBA蛋白〔30〕。

LOXL3基因mRNA在心脏、脾脏、子宫、髓质、脊髓和卵巢中的表达水平最高〔14，31〕。LOXL3和LOXL4基因mRNA在侵袭能力强的弥漫型胃癌细胞中表达水平显著增高。LOXL3蛋白表达于细胞质和细胞核，主要表达于细胞核〔32〕。LOXL3基因表达升高与胃癌浸润、淋巴和静脉浸润以及淋巴结转移相关。与LOXL3蛋白阴性表达的胃癌患者相比，LOXL3蛋白阳性胃癌患者的临床结局不佳〔33〕。另外，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）在胃癌细胞中能够诱导LOXL3蛋白表达上调，表明LOXL3蛋白是TGF-β信号通路的下游分子。然而，仍然需要更多的研究来进一步验证LOXL3蛋白在胃癌中的致癌作用。

2.5 LOXL4蛋白与胃癌发生发展的相关性LOXL4蛋白具有抑制肿瘤或促进肿瘤，调控细胞发育和衰老，诱导细胞趋化性等作用。LOXL4蛋白在肿瘤发生过程中形成免疫抑制微环境〔34〕。LOXL4蛋白还可以通过外泌体形式促进自身的迁移及上皮细胞的增殖、迁移和血管的形成，导致肿瘤发生侵袭和转移〔35〕。

目前，LOXL4蛋白被报道为胃癌中的促癌蛋白〔36〕。LOXL4蛋白表达在胃癌组织中高于配对的非癌组织，并且与肿瘤大小、癌浸润深度、淋巴结转移和T、N、M分期呈正相关，可用于预测胃癌患者的不良临床结局。此外，LOXL4基因的表达上调促进了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并通过激活Src/FAK信号通路促进ECM黏附。与此一致的是，调低LOXL4基因对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭具有抑制作用。TGF-β是肿瘤细胞中LOXL4蛋白表达的关键调节因子，它可以诱导LOXL4蛋白的表达。研究〔33〕显示，TGF-β能够降低胃癌细胞LOXL1蛋白表达并增加LOXL3和LOXL4蛋白的表达。LOXL4蛋白可能是胃癌的一个独立的预后标志物和潜在的治疗靶点。

3 总结与展望

胃癌对人类健康的危害很大，患者治疗效果差和预后差的原因主要有两个方面:一方面是诊断和发现不及时，大部分患者就诊时已是晚期，另一方面是胃癌容易发生浸润和转移。已有的研究表明，LOX家族蛋白质各成员调控胃癌发生、发展的各种重要过程，主要发挥促癌作用。这为开发LOX家族蛋白质成员的特异性抑制剂用于治疗胃癌提供了可能。值得一提的是，为了充分阐明和理解LOX家族蛋白质在胃癌发生和进展中的作用，仍然需要解决多个问题。目前，大部分的研究解析了LOX家族蛋白质的下游靶点，但LOX家族蛋白质成员如何被上游基因调控以及如何发生蛋白质降解尚不清楚。为了更深入地确定LOX家族蛋白质成员的功能，应建立基因敲入和基因敲除等工程小鼠模型。此外，还需要对抑制LOX家族蛋白质的小分子抑制剂进行高通量筛选，以发现可用于胃癌治疗的LOX家族蛋白质成员的特异性抑制剂。