高效液相色谱法测定乳与乳制品中柚皮苷

宫慧丽，段国霞，刘丽君，陈素敏，谢瑞龙，刘春霞，陈 静，武伦玮，刘 旺，唐 烁，李翠枝，吕志勇

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

柚皮苷是柚皮提取物的活性成分之一[1-2]，又名柚苷、异橙皮苷，全称为柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一种双氢黄酮类化合物[3-5]，主要存在于芸香科植物柚、葡萄柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮以及胡柚的外层果皮中[6-8]。同时，柚皮苷是形成柚皮苦味的主要物质（占柚皮中苦味物质的80%以上）[9-11]。因此，柚皮苷经常可作为苦味剂或风味改良剂、天然色素应用于食品及药品的生产[12-13]。柚皮苷的多种生物活性及药理作用，如抗氧化、抗突变、抗病毒、抗过敏[14-16]、抑菌、改善局部微循环、降血压和减少血栓形成[17-19]等，在医药、食品等领域有广泛应用[20-21]。因此，柚皮苷越来越倍受关注。乳与乳制品中添加柚皮苷（药食同源性化合物）为标志性成分的新产品，不仅能改善其口感，还能增加其功效。目前，液相色谱法测定药品中柚皮苷的含量[22-24]较为常见，也有高效液相色谱法测定牙膏[25]、柑橘类果实[26]、柚子[27]中柚皮苷的含量，以及超高效液相色谱法测定儿童指画印泥中柚皮苷和苯甲酸地那铵含量[28]。而乳与乳制品中柚皮苷采用高效液相色谱检测的方法较少见。因此，本研究建立高效液相色谱法测定乳与乳制品中柚皮苷含量的方法，为乳与乳制品中柚皮苷的检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市场随机抽取乳粉、液态乳和酸乳样品，并在抽取的乳粉样品中选取一种样品添加1、2 g/100 g和4 g/100 g含柚皮苷的骨碎补原料（添加含柚皮苷的骨碎补原料样品制备方法：取100 g乳粉样品3 份，分别加入1、2、4 g含柚皮苷的骨碎补原料，充分混匀；加标回收实验中：分别选择不含柚皮苷的乳粉、液态乳和酸乳，添加不同质量浓度的柚皮苷标准溶液进行实验）。其中，乳粉样品6 份、乳粉中添加不同含量的骨碎补原料乳粉3 份、液态乳样品5 份、酸乳样品5 份。

柚皮苷对照品（纯度≥95%） 德国Sigma公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯） 成都科隆化学品有限公司；无水乙醇（色谱纯） 福晨（天津）化学试剂有限公司；冰乙酸（色谱纯） 天津市光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

U3000高效液相色谱仪（配备二极管阵列检测器）、Pro UV超纯水机 美国赛默飞世尔公司；AL204分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；MS 3 Basic涡旋振荡器德国IKA公司；KQ-300DE超声波振荡器 昆山超声仪器有限公司；3K30高速离心机 德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

准确称取固体样品1.0 g（精确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，加入2 mL水混匀，再加入甲醇定容至刻度，摇匀。液体样品称取2.0 g（精确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，再加入甲醇定容至刻度，摇匀。超声处理1 h，取出，冷却至室温。转入离心管后以8 000 r/min、4 ℃离心5 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为试样待测液。

1.3.2 标准溶液制备

柚皮苷标准储备液（1.0 mg/mL）：准确称取柚皮苷标准品50 mg（精确至0.1 mg）于50 mL容量瓶中，加入60%甲醇溶液超声溶解，用60%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，备用。

柚皮苷标准中间液（500 μg/mL）：准确吸取柚皮苷标准储备液5 mL于10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，现用现配。

柚皮苷标准工作液：分别准确吸取标准中间液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液溶解并定容至刻度，混匀，此标准工作液的质量浓度分别为5、10、20、50、100、200、500 μg/mL，现用现配。

1.3.3 仪器工作条件

检测器：二极管阵列检测器；色谱柱：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 mm）；流速1 mL/min；检测波长284 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃；流动相：体积分数0.1%醋酸水溶液-乙腈（75∶25，V/V）。

试样中柚皮苷的含量按下式计算。

式中：X为试样中待测组分含量/（g/100 g）；ρ为由标准曲线得出的试样液中待测物质量浓度/（μg/mL）；V为试样定容体积/mL；m为试样质量/g；10 000为单位换算系数。

1.4 数据处理

采用Excel软件对数据和图谱进行处理和绘制，加标回收率采用3水平6平行实验测定[29]。

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

使用添加4 g/100 g含柚皮苷的骨碎补原料乳粉为样品，优化实验条件。

甲醇、无水乙醇和乙腈均能和水混溶，是沉淀蛋白常用的有机溶剂。因此，选用甲醇、无水乙醇和乙腈3 种提取剂进行实验。采用甲醇和无水乙醇提取的样品能得到分离效果良好的色谱峰，而乙腈提取的样品未能得到分离效果良好的色谱峰。因为柚皮苷溶于甲醇和无水乙醇，所以甲醇和无水乙醇能提取出样品中的柚皮苷，由于甲醇的极性比无水乙醇极性强，使得甲醇的提取效率高于无水乙醇。而柚皮苷不溶于乙腈，所以乙腈不能提取出样品中的柚皮苷。

由图1可知，甲醇提取柚皮苷含量的平均值为0.069 3 g/100 g，无水乙醇提取柚皮苷含量的平均值为0.055 3 g/100 g，甲醇的提取效率比无水乙醇高1.3 倍。因此，选用甲醇作为柚皮苷的提取剂。

图1 使用甲醇和无水乙醇提取对柚皮苷含量的影响Fig.1 Effects of extraction solvent on naringin content

2.2 加水量的选择

分别向1.0 g乳粉样品中加入0、2、5 mL水溶解，用甲醇定容，超声后离心。不加水的样品，加入甲醇后，样品很快形成团块，且无法散开，导致甲醇不能有效提取团块内部的柚皮苷，使提取效率降低。加入2 mL水溶解使样品充分被水浸润，提高了甲醇的提取效率，同时甲醇能降低溶液的电解常数，从而增强蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低，另外，甲醇与水的作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质析出。当加水量为5 mL时，再加入甲醇，无法达到蛋白质沉淀的甲醇浓度，因此，蛋白质无法析出，样品不能进行上机测试。

由图2可知，不加水时，甲醇提取柚皮苷含量的平均值为0.002 3 g/100 g，样品的提取效率较低。当加水量为2 mL时，甲醇提取柚皮苷含量的平均值为0.069 3 g/100 g，样品的提取效率明显提高，比不加水的提取结果高30.1 倍。因此加入2 mL水溶解样品。

图2 加水量对柚皮苷提取的影响Fig.2 Effect of amount of water used to dissolve sample on naringin extraction

2.3 流速的选择

改变色谱柱流速分别为1.0、0.8、0.5 mL/min，由图3可知：色谱柱流速为0.5 mL/min时，色谱峰的出峰时间为9.727 min，色谱峰出现明显的拖尾和展宽现象；流速为0.8 mL/min时，色谱峰的出峰时间为6.083 min，色谱峰出现拖尾和展宽现象；流速为1.0 mL/min时，色谱峰的出峰时间为4.883 min，出峰时间最短，峰型尖锐，且对称性较好。故1.0 mL/min为色谱柱的最佳流速。

图3 流速对柚皮苷色谱峰的影响Fig.3 Effect of flow rate on the naringin chromatographic peak

2.4 检测器的选择

通过实验发现，柚皮苷在284 nm波长附近有强烈的紫外吸收峰，二极管阵列检测器和紫外检测器均能满足检测要求。依据实验室条件，选择二极管阵列检测器进行检测。

2.5 线性关系、检出限和定量限

以柚皮苷峰面积为纵坐标，柚皮苷标准工作液质量浓度为横坐标进行线性回归，其回归方程为y=0.195 1x-0.050 2（R2=0.999 9），线性范围符合要求。由表1可知：乳粉、液态乳和酸乳样品中柚皮苷检出限的信噪比（RS/N）均大于3，符合检出限要求；乳粉、液态乳和酸乳样品中柚皮苷定量限的RS/N均大于10，符合定量限要求。

表1 检出限和定量限Table Limit of detection and limit of quantification for milk product samples

2.6 精密度实验

按实验方法计算乳粉、液态乳和酸乳6 次检测结果的相对标准偏差。由表2可知，对乳粉、液态乳和酸乳样品进行重复性实验，根据GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[30]的要求，被测组分含量为1%时，相对标准偏差≤2.7%，本研究结果相对标准偏差分别为1.12%～2.31%、1.25%～1.85%和1.24%～1.66%，均＜2.7%，实验结果重复性符合要求。

表2 精密度实验结果（n=6）Table 2 Results of precision test (n = 6)

2.7 准确度实验

按照实验方法，对乳粉、液态乳和酸乳进行加标实验，加标量分别为定量限、2 倍定量限和4 倍定量限。由表3可知，乳粉、液态乳和酸乳的加标回收率分别为96.2%～103.2%、96.3%～103.7%和99.7%～104.1%，根据GB/T 27417—2017的要求，被测组分含量＞100 mg/kg，加标回收率为95%～105%，因此本研究结果准确度符合要求。

表3 准确度实验结果（n =6）Table 3 Results of accuracy test (n=6)

2.8 样品测定结果

由表4可知，乳粉、液态乳和酸乳中均未检出柚皮苷，而添加含柚皮苷的骨碎补原料乳粉中柚皮苷含量分别为0.017 2、0.033 4、0.069 5 g/100 g。

表4 乳粉、液态乳、酸乳及含柚皮苷的骨碎补原料乳粉测定结果Table 4 Results of HPLC detection of naringin contents in milk powder, liquid milk, yogurt and drynaria with added naringin

3 结 论

本方法建立了高效液相色谱法测定乳与乳制品中柚皮苷含量的方法。样品经甲醇提取，在284 nm检测波长下，流动相为体积分数0.1%醋酸水溶液-乙腈（75∶25，V/V），C18色谱柱分离，经二极管阵列检测器检测，外标法定量。结果表明：此方法的线性关系良好，加标回收率分别为96.2%～103.2%、96.3%～103.7%和99.7%～104.1%，符合GB/T 27417—2017加标回收率为95%～105%的要求，相对标准偏差（n=6）为1.12%～2.31%，符合GB/T 27417—2017中被测组分含量为1%时，相对标准偏差≤2.7%的要求；将该方法应用于样品的测定，其稳定性、重复性和准确性良好，可作为乳与乳制品中柚皮苷含量的测定方法。