介质阻挡放电低温等离子体对酪蛋白粉末结构及成膜性影响

王雅娟，刘琦，牟光庆，吴晓萌

（大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034）

近年来，随着全球经济的快速发展，人们的环保意识也越来越强烈，可食用包装膜已成为代替不可降解包装的重要材料。食品包装膜是用来保护食品在运输的过程免受外力的损坏，这些包装膜大多是由蛋白质、脂类或是多糖制成[1]，其中酪蛋白制成的薄膜具有良好的理化特性，这是由于酪蛋白中含有较多的钙离子和其他盐离子[2]。但是大多数的蛋白质膜的水蒸气透过率较差，这阻碍了其在食品包装中的应用[3]。因此，学者采用了各种方法来提升蛋白膜的包装特性，如：热处理和紫外线诱导等[4]。

等离子体是除气体、液体和固体以外，物质存在的第四种状态。等离子体加工是对材料表面进行改性，以达到对表面进行处理的目的[5-6]。低温等离子技术（cold plasma，CP）是一种非热加工技术，无害且适用于处理膜来改变材料的物理性能，现已多被应用于食品工业中[7]。低温等离子技术是电子从电场中获得能量，通过碰撞将能量转化为分子的内能和动能，获得能量的分子被激发，与此同时，部分分子被电离，这些活化后的粒子相互碰撞从而引起一系列复杂的物理化学反应[8]。正如许多论文所报道的，低温等离子技术被认为是一种潜在的技术，用以改变材料性能，如亲水性、柔韧性、拉伸强度（tensile strength，TS）和水蒸气渗透性（water vapor permeability，WVP）[9]。低温等离子技术可以改变明胶基薄膜的表面粗糙度、极性基团浓度和亲水性，但处理后薄膜的水蒸气和氧气渗透性等阻隔性能没有显著变化[10]。在乳清和麸质薄膜中，机械性能包括拉伸强度（TS）和断裂伸长率（elongation at break，EAB）都得到了提高，但介质阻挡放电低温等离子体（dielectric barrier discharge-cold plasma，DBD-CP）处理并没有显著改变这两种蛋白质薄膜的屏障性能和溶解度[11]。

DBD-CP技术可以改变材料的基本性能[12]。前期研究表明DBD-CP可以通过改变酪蛋白膜的结构特性进而影响膜的包装性能，这可能与酪蛋白膜被DBD-CP处理后影响膜中水分子迁移进而导致膜的晶体物质迁移，从而改变了酪蛋白的排列结构有关[3]。此外，研究表明DBD-CP可以改变牛奶蛋白质的结构，导致牛奶蛋白质胶束的粒径减小，结构更加稳定[13]。因此，本文以DBD-CP处理酪蛋白粉末的电压和时间为变量，采用DBD-CP技术对酪蛋白粉末进行改性，并对处理后的成膜性的变化进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酪蛋白（＞80%）、甘油（＞99.0%）：Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

V-100D型可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；TA-XTplus型质构仪：英国Stable Micro System公司；DK-S22型电热恒温水浴锅：上海精密实验设备有限公司；Binder KBF720型恒温恒湿箱：德国宾得有限公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥器：上海森信实验仪器有限公司；PL303型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HJ-4A型数显恒温磁力搅拌器：常州智博瑞仪器制造有限公司；Dura12F型超纯水系统：泽布拉仪器科技（上海）有限公司；DF-101s型加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限公司；VORTEX-GENIE2型旋涡混合器：美国Scientific Industries公司；IKA RT5型数显恒温磁力搅拌器：德国IKA有限公司；Spectrum 10型傅里叶变换红外光谱仪：美国PE公司；DBD-50等离子体反应器：南京苏曼有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DBD-CP处理

称取一定量的酪蛋白粉末样品于石英反应皿中（d=90 mm），使用DBD-50等离子体反应器处理样品，不同的条件（处理电压和处理时间）设置如下：处理电压变化组在处理时间为60 s的条件下，电压设定为0、30、40、50、60 V 和 70 V；处理时间变化组在 50 V 的处理电压下，处理时间为 0、15、30、45、60、90 s和 120 s。各处理均在石英反应器上进行，所有样品均以（2.0±0.2）A电流处理，试验进行3次重复。

1.3.2 制膜方法

用0.5 mol/L的氢氧化钠溶液溶解DBD-CP处理后的酪蛋白粉末，并添加甘油作为增塑剂，成膜液为酪蛋白∶甘油∶氢氧化钠溶液=5∶1∶30（体积比）的乳状液。为了使其快速混合，将混合物置于50℃恒温磁力搅拌器中搅拌，随后对成膜液进行除气。搅拌均匀后，小心地将成膜液倾注到聚丙烯酸板上（15 cm×15 cm）。然后将所有的膜样保存在恒温恒湿箱中，调节相对湿度为50%，温度为25℃，放置48 h。随后，将所有薄膜样品剥离，并将其置于50%相对湿度的恒温恒湿箱中，室温保存7 d，以评估薄膜性能。所有膜样品均做3个平行。

1.3.3 扫描电子显微镜

利用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）对酪蛋白膜的微观结构进行了研究，粉末样品和薄膜样品分别用导电双面胶固定在样品台上，随后喷金。在加速电压为5 kV时进行SEM扫描。对DBD-CP处理后的酪蛋白粉末制备成的膜进行形态学观察[14]。

1.3.4 X射线衍射

用X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）仪测量处理后样品的结晶度。将粉末样品平铺在样品台上，并刮去多余的样品，并且薄膜样品剪裁成4 cm×3.3 cm的规格固定在仪器的样品台。设定电流30 mA，电压40 kV，以 5 °/min 的速度扫描 10°～80°[15]。

1.3.5 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）

将制备的薄膜样品使用傅里叶变换红外光谱的衰减全反射模式对样品进行功能基团和二级结构的变化分析。对于每个薄膜样品，在4 000 cm-1～1 000 cm-1的波数范围内进行4 cm-1分辨率的扫描。然后用Omnic 8.2软件对样品的光谱进行分析[16]。

1.3.6 差示扫描量热法

采用差示扫描量热法（differential scanning calorimeter，DSC）表征酪蛋白膜的热稳定性。将8 mg～10 mg的膜样以5℃/min的升温速率加热，温度从25℃提高到500℃。氮气流量为20 cm3/min[17]。

1.3.7 机械性能

薄膜的拉伸强度（TS）和断裂伸长率（EAB）用质构仪测定。将膜切成10 mm×40 mm的条状，样品放入膜延长夹具中。初始夹距设定为20 mm，拉伸速度为10 mm/s，有效拉伸距离为20 mm。记录薄膜样品的TS和EAB值，测量3次[18]。按照以下计算公式进行计算。

式中：Ft为膜破裂时记录的最大载荷，N；T为膜厚，mm；W为膜宽，20 mm；ΔL是膜的伸长长度，mm；L0为膜的初始长度，70 mm。

1.3.8 水蒸气透过率测定

采用拟杯状法测定膜的阻隔性。称取干燥氯化钙3.0 g（120℃干燥12 h）加入恒重玻璃杯中，将薄膜密封在玻璃杯上，称量被薄膜覆盖的玻璃杯的质量。然后将玻璃杯置于恒温恒湿箱中，温度为25℃，相对湿度为50%。每隔1 h测量薄膜覆盖玻璃杯的质量，并记录数据。连续测量7 h[19]。通过以下公式进行计算。

式中：WVP为水蒸气透过率，g·m/（Pa·s·m2）；ΔW为杯重增加量，g；L 为膜厚，m；t为测量时间，s；A 为测量面积，m2；ΔP 为杯内外压力差，Pa。

1.4 数据分析

每组试验至少3组平行并重复2次～3次。试验结果主要采用软件SPSS Statistics 20中的Duncan检验，在置信区间95%的水平用ANOVA分析方法进行数据显著性分析，p＜0.05时认为差异显著。用不同字母表示差异显著（p＜0.05），用软件 Origin8.5绘图。

2 结果与分析

2.1 表观形貌

2.1.1 酪蛋白形态结构

DBD-CP处理酪蛋白的SEM图像如图1所示。

DBD-CP处理改变了酪蛋白粉末的表面粗糙度，酪蛋白粉末表面由光滑变为粗糙；同时，随着处理时间延长和电压的增加，酪蛋白胶束的粒径减小。这与DBD-CP放电过程中产生的蚀刻作用有关，DBD-CP处理产生的高能粒子撞击酪蛋白粉末表面，显著改变其表观形貌[20]。此外，DBD-CP放电过程中产生大量电子、离子等活性物质攻击酪蛋白，也会导致化学键断裂、链断裂、化学降解、低分子量碎片去除等化学和物理变化，进而会影响膜的结构和理化性质[21]。

2.1.2 成膜的形态结构

对处理后的酪蛋白制成的膜的形态学进行分析，结果如图2所示。

膜表面有大量的晶体，晶体数量随着处理电压和处理时间的增加而变化。同时，图2中的截面呈现出相反的趋势，处理时间变化组中，表面随着处理时间延长，晶体量呈增多趋势；而在截面中，随着处理时间的增加，晶体量逐渐减少。

电子扫描显微镜的能谱如图3所示。

由图3可以看出，表面的晶体与Na+的结构最为相似，因此，可推测其为Na+组成的晶体。晶体随DBDCP处理发生变化的原因可能是晶体随着酪蛋白粉末中的水产生了迁移，但这一解释需要进一步的试验研究来证实。

2.2 XRD分析

DBD-CP处理酪蛋白粉末的XRD图谱如图4所示。

由图4可见，宽的衍射峰发生在未经处理的酪蛋白样品中，2 θ=20°。经比较，DBD-CP处理后的蛋白峰值降低，说明蛋白内螺旋侧链结构含量与之相关，性质不稳定，易受环境等因素影响[22]。随着处理电压和处理时间的增加，没有新的衍射峰出现，这意味着DBD-CP处理不能使得酪蛋白中产生新的晶体结构。从图4A可以看出，衍射强度随着处理时间的延长逐渐增大，直到60 s达到峰值，然后减小。如图4B所示，衍射峰强度随着处理电压的增加而逐渐减小，尤其表现在2 θ=20 °～25 °处。

DBD-CP处理酪蛋白粉末后制成的膜的XRD图谱如图5所示。

从图像的趋势可以看出，各峰值随处理时间延长而增高，在50 V 60 s达到最高。处理电压变化组中，随着处理电压强度的增加峰的强度增强，直到50 V，然后下降。据悉，晶体的尺寸和晶体的折叠都会引起X射线衍射峰的变化[23]。因此，晶体衍射峰发生的变化可能是由于DBD-CP放电破坏了酪蛋白质的结构，致使成膜后的晶体结构发生了变化。

2.3 蛋白质二级结构分析

DBD-CP处理后酪蛋白粉末制成的膜的红外光谱如图6所示。

FTIR光谱是根据结构振动来分析分子水平上的结构变化来探讨官能团的转移。等离子体处理对3 600 cm-1～3 300 cm-1的振动产生了影响，这个波数范围为O—H和N—H的特征振动，这是由于当分子间或分子内氢键形成时，羟基的吸收峰向较低的波数移动[24]。在处理时间变化组中，可以看出随着处理时间的延长，样品的吸收峰逐渐变宽，波数在3 400 cm-1处略有变化，这表明DBD-CP对蛋白质中O—H产生了一定的影响。

酰胺Ⅰ区的波数范围为1700 cm-1～1600 cm-（1CO拉伸振动），这与蛋白质的二级结构密切相关。蛋白质的二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲结构。不同的二级结构信息叠加在酰胺Ⅰ带上，而酰胺Ⅰ带的二阶导数光谱保留了吸收峰的积分面积。波数与二级结构的关系：1 610 cm-1～1 640 cm-1为 β-折叠特征峰；1 660 cm-1～1 670 cm-1和 1 680 cm-1～1 700 cm-1为 β-转角特征峰；1 650 cm-1～1 660 cm-1为 α-螺旋特征峰；1 640 cm-1～1 650 cm-1为无规卷曲特征峰[25]。

不同处理时间和不同处理电压的样品的二级结构的含量见表1。

表1 DBD-CP处理的酪蛋白粉末制备成膜的二级结构Table 1 Secondary structure of films made from casein power samples treated by DBD-CP

随着DBD-CP处理时间的延长，β-折叠在50 V 90 s达到最高值（37.57%）。在处理电压变化组中，β-折叠在40 V 60 s的处理条件下含量为74.15%，而在70 V 60 s时则含量为17.48%。α-螺旋含量均比对照组含量低，其中在40 V 60 s时含量最少。由此可以得出结论：DBD-CP处理后酪蛋白的α-螺旋结构以及二

级结构中的无规卷曲均受到影响。然而，无规卷曲可以改变肽链的方向，这有利于α-螺旋和β-折叠持有相对刚性的连接结构[26]。因此，DBD-CP处理酪蛋白粉末后可影响酪蛋白膜的结构稳定性。

2.4 热稳定性分析

差示扫描量热法是研究蛋白质稳定性热力学的主要工具。热性能对食品包装材料的生产和灭菌过程具有重要影响，不同处理条件的DSC结果如图7所示。

图7结果表明，所有薄膜均表现出2种～3种典型的吸热过程。第1个峰是结晶峰，与样品物质的结晶度有关[27]。从第1个峰可以看出，与对照组相比，除30 V 60 s外所有组的峰值均有不同程度的降低，同时各处理组的结晶峰均有不同程度的加强。结合傅里叶红外光谱的分析结果，可以推测出DBD-CP改变了酪蛋白的分子结构，破坏了分子间和分子内氢键，改变了聚合物的连接状态，从而影响了膜的热稳定性。除处理条件在50 V 45 s的样品外，其余处理时间变化组的第二个峰值（Tp值）高于对照组，在50 V 60 s的处理条件下达到最大值245.2℃。电压变化组在40V60s和70V 60 s条件下的Tp值低于对照组，并且在等离子处理后酪蛋白分子结构发生变化，破坏了相应的变化结构。这些相关现象的变化与扫描电镜及红外光谱结构分析结果一致。DBD-CP处理可以通过改变酪蛋白分子间结构以及分子在膜液体中的聚集和晶体结构来改善酪蛋白膜的热稳定性。

2.5 机械性能分析

商品在生产过程中，会受到压力、冲击、振动等静态和动态因素的影响。因此包装材料应具有有效保护产品的特性，并具有一定的强度、韧性和弹性。DBDCP酪蛋白粉末制备成膜样品的力学性能如图8所示。

在酪蛋白膜的制备过程中加入甘油，有利于酪蛋白膜的形成，提高酪蛋白膜的力学性能。以往的许多研究表明，DBD-CP处理蛋白膜后，其拉伸强度和断裂伸长率得到了提高[28]。然而，从图8中可以看出，DBDCP处理酪蛋白粉末制成的膜并没有显示出这种趋势。处理时间变化组与对照组相比较具有显著性差异（p＜0.05）。随着处理时间的延长，TS值逐渐减小，其中在50V 90 s时TS值最小。处理时间变化组在30 s和45 s、30 s和60 s之间差异无显著性（p＞0.05），TS值变化不大。图8A中可以看出，DBD-CP无论在处理电压变化组还是处理时间变化组中，机械强度均发生了显著的降低（p＜0.05）；图8B中可以清晰看出，EAB值也随着电压的升高而变化，与对照组相比，在50 V 60 s时EAB值最低，在处理条件为60 V 60 s的时候，EAB显著高于对照组，结合红外二级结构分析得出DBD-CP处理后蛋白膜的TS值降低可能是由于经过处理后的酪蛋白粉末的二级结构发生了变化。α-螺旋多肽链的蛋白质可以扭曲在一起以提高其机械强度和灵活性。无规则卷曲和α-螺旋结构的减少也影响膜的力学性能。因此，可以得出：DBD-CP处理的酪蛋白粉末二级结构中的α-螺旋和无规则卷曲被破坏，从而降低了酪蛋白膜的机械强度，但是增加了酪蛋白膜的极限拉伸率。

2.6 水蒸气透过率

包装材料的阻水性是决定食品保质期的重要因素，水蒸气透过率代表了薄膜阻止水分子从外部环境迁移到产品中的能力，然而有些膜材料却需要具有一定的水蒸气透过率（如：肠衣等），一定的水蒸气透过率有助于降低薄膜在热处理时因水蒸气不能透过而引起的涨破。DBD-CP时间变化组和电压变化组对薄膜水蒸气透过率的影响如图9所示。

水蒸气透过率的大小主要受包装材料的组成物质及空间结构的影响[29]。图9显示了DBD-CP时间变化组和电压变化组对薄膜水蒸气透过率的影响，总体趋势是先上升后下降再上升。从图中可以看出处理条件为40V60s的水蒸气透过率显著高于对照组（p＜0.05），增加了127.4%。而50 V与60 V比较无显著性差异（p＞0.05）。同时等离子体处理时间延长组也表现出整体上先上升后下降的趋势。这可能是由于等离子体放电破坏了酪蛋白的结构，使其聚集且表面结构也变疏松，从而减弱了水蒸气的阻隔性能。

3 结论

综上所述，介质阻挡放电低温等离子体（dielectric barrier discharge-cold plasma，DBD-CP）处理改变了酪蛋白的结构，使酪蛋白粉末表面由光滑变得粗糙，同时结合傅里叶红外变换光谱的结果与DSC结果可以发现，DBD-CP处理还破坏了氢键，改变了聚合物的连接状态，使酪蛋白的稳定性发生变化。通过与未处理的样品相比，经过DBD-CP处理的样品由于结构发生的改变从而促使酪蛋白膜的热稳定性得到了提高（在50 V 60 s的处理条件下Tp值可达245.2℃），并且在处理条件为40 V 60 s时，样品的水蒸气透过率显著高于未处理的样品，这说明DBD-CP处理有效地改变了酪蛋白膜的水蒸气透过率。这为低温等离子体改性膜原料的选择提供了参考依据。