酪蛋白对双羧基1，8—萘酰亚胺荧光探针聚集诱导发光效应的光谱研究及分析应用

刘振　孙洋

摘要：建立高效快速、操作简便、价格低廉的乳品真蛋白检测方法具有重要意义。本实验合成了具有双羧基官能团的水溶性1，8萘酰亚胺荧光探针2，探针2对酪蛋白具有特异性发光效应，其机理是双羧基为前导嵌入基团插入酪蛋白胶团子域的疏水腔中，与色氨酸、酪氨酸等氨基酸残基以氢键及疏水作用相结合后使酪蛋白胶团结构收缩，萘酰亚胺荧光基元吸附于酪蛋白胶团表面呈现聚集诱导发光效应 （Aggregation induced emission， AIE）。以300 nm为激发波长，一定范围内探针2在480 nm附近处发光强度与酪蛋白浓度成正比，在pH 5.5条件下建立了酪蛋白AIE定量分析方法；线性范围为0.1～9.5 mg/L，检出限 （3σ）为2.9 mg/L，对不同浓度酪蛋白平行测定9次，相对标准偏差<3%；三聚氰胺、铵肥、尿素、乳清蛋白、血清蛋白、I型胶原蛋白及粗卵清蛋白等对于测定结果无显著影响（±5%），用于奶粉中总酪蛋白含量的测定结果与双缩脲法相一致。

关键词：1，8萘酰亚胺； 双羧基； 酪蛋白； 聚集诱导发光

1引言

乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白（包括乳白蛋白和乳球蛋白）及少量脂肪球膜蛋白，上述蛋白构成了乳中的“真蛋白”[1]。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白质，约占总蛋白量的80%，主要以胶团形式存在。酪蛋白是以磷蛋白质为主体的几种蛋白质的复合体，主要分为αsl酪蛋白、 αs2酪蛋白、 β酪蛋白和κ酪蛋白4种[2]。由于国标中乳品蛋白质检测方法的缺陷，出现掺加尿素、 铵肥、 三聚氰胺等氮含量高的有机物来提高“蛋白质含量”的违法行为，严重制约了我国乳制品的质量提升，影响了消费者的健康。目前现行的乳品中蛋白质的检测方法[3]会受脂肪及碳水化合物等因素干扰，尤其该法对水解蛋白及动物蛋白等劣质蛋白具有相似的响应作用，同样为不法分子掺加劣质蛋白以提高蛋白质含量提供可乘之机。为此亟需建立适应新掺假情况的快速、 高效的真蛋白检测方法。

目前， 酪蛋白检测方法有凯氏定氮法[4]、 双缩脲法[5]、 四阶导数分光光度法[6]、 液质联用法[7]、 ELISA法[8]、 电泳法[9]、 蛋白质免疫印迹[10]、 反相色谱[11]、芯片[12]及荧光探针法[13]。但这些方法都具有不同程度的局限性，如灵敏度和选择性较差、检测仪器价格昂贵、操作过程复杂等。近来，Wang等[13]报道了基于BSPOTPE探针对酪蛋白胶团微环境极性的改变产生聚集诱导发光现象 （Aggregation induced emission， AIE），并建立了酪蛋白的检测方法，但探针只影响酪蛋白微环境的极性，并未与酪蛋白胶团发生结合作用。

本课题组报道了1，8萘酰亚胺类荧光探针与酪蛋白相互作用后的AIE特性[14～16]。本实验合成了新型双羧基水溶性1，8萘酰亚胺类荧光探针2，研究了酪蛋白对探针2的聚集诱导发光效应的机理，根据探针2对酪蛋白特异性的识别作用，建立了酪蛋白检测新方法并应用于实际奶粉中总酪蛋白含量的测定。本方法具有快速高效等特点，为乳品质量安全监测提供了重要信息。

2实验部分

2.1仪器和试剂

2.3光谱测定

以280 nm为激发波长，300～400 nm范围内测定酪蛋白内源荧光发射光谱；以300 nm为激发波长，在440～600 nm范围内测定探针2与酪蛋白体系发射光谱，入射和出射狭缝带宽均为5 nm。

3结果与讨论

3.1探针2与酪蛋白聚集诱导发光机理

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白质，约占总蛋白含量的80%，主要以胶团状态存在于乳品中，它是以含磷蛋白质为主体的几种蛋白质的复合体，主要分为αsl酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白4种[2]。其中αs1酪蛋白和αs2酪蛋白含有4个色氨酸残基， 包括Trp164， 199， 109和193； 而β酪蛋白和κ酪蛋白各自含有1个色氨酸残基， 分别为Trp143和176。除此之外， 酪蛋白还含有大量疏水性的酪氨酸残基。色氨酸和酪氨酸残基位于位于酪蛋白疏水腔第一和第二子域之间，对于酪蛋白胶团的自组装具有重要作用，同时也是酪蛋白在350 nm附近内源性荧光的主要体现基团[17]。作者设想探针2的双羧基作为前导嵌入式基团插入酪蛋白疏水腔中，与色氨酸和酪氨酸残基以非共价键作用，如疏水、氢键作用等相结合，导致未结合的氨基酸残基包埋在疏水腔中，使得酪蛋白胶团结构更加紧实；而1，8萘酰亚胺荧光基元则吸附于胶团表面导致探针分子的聚集，引起聚集诱导发光效应[18]。

以300 nm为激发波长，考察了酪蛋白对探针2荧光光谱的影响（pH 7.4），如图2A所示，随着酪蛋白浓度的增加，探针2在480 nm附近呈现显著的荧光增强并伴随最大发射峰蓝移；图2B为浓度为0～5.0 g/L的酪蛋白对探针2颜色的影响，随着酪蛋白浓度的增加，探针2的发光效应逐渐增强；结果表明，探针2与酪蛋白发生结合作用，形成新的发光复合物，并且复合物的疏水性随着酪蛋白浓度的增加而逐渐增大。

为了研究酪蛋白与探针2的荧光增强机理，考察了不同浓度探针2对酪蛋白荧光及吸收光谱的影响（pH 7.4），酪蛋白的内源性荧光主要由色氨酸和酪氨酸体现，如图3A所示，当激发波长为280 nm时，酪蛋白在350 nm附近呈现特征荧光峰，探针2在395 nm处呈微弱荧光，随着探针2浓度的增加，酪蛋白荧光被逐渐猝灭并伴随显著的蓝移；同时在475 nm附近出现新的发射峰，且光强逐渐增大，发射峰向短波长方向移动。结果表明，探针2与酪蛋白发生结合作用，酪蛋白中的色氨酸和酪氨酸残基发色团的疏水性增加，包埋进疏水腔中；而450 nm附近新峰的出现表明形成了探针2酪蛋白复合物，且复合物的疏水性随着探针2浓度的增加而逐渐增大。此外在400 nm处出现的等吸收点表明酪蛋白从游离态向探针2的结合态转变。

摘要：建立高效快速、操作简便、价格低廉的乳品真蛋白检测方法具有重要意义。本实验合成了具有双羧基官能团的水溶性1，8萘酰亚胺荧光探针2，探针2对酪蛋白具有特异性发光效应，其机理是双羧基为前导嵌入基团插入酪蛋白胶团子域的疏水腔中，与色氨酸、酪氨酸等氨基酸残基以氢键及疏水作用相结合后使酪蛋白胶团结构收缩，萘酰亚胺荧光基元吸附于酪蛋白胶团表面呈现聚集诱导发光效应 （Aggregation induced emission， AIE）。以300 nm为激发波长，一定范围内探针2在480 nm附近处发光强度与酪蛋白浓度成正比，在pH 5.5条件下建立了酪蛋白AIE定量分析方法；线性范围为0.1～9.5 mg/L，检出限 （3σ）为2.9 mg/L，对不同浓度酪蛋白平行测定9次，相对标准偏差<3%；三聚氰胺、铵肥、尿素、乳清蛋白、血清蛋白、I型胶原蛋白及粗卵清蛋白等对于测定结果无显著影响（±5%），用于奶粉中总酪蛋白含量的测定结果与双缩脲法相一致。

关键词：1，8萘酰亚胺； 双羧基； 酪蛋白； 聚集诱导发光

1引言

乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白（包括乳白蛋白和乳球蛋白）及少量脂肪球膜蛋白，上述蛋白构成了乳中的“真蛋白”[1]。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白质，约占总蛋白量的80%，主要以胶团形式存在。酪蛋白是以磷蛋白质为主体的几种蛋白质的复合体，主要分为αsl酪蛋白、 αs2酪蛋白、 β酪蛋白和κ酪蛋白4种[2]。由于国标中乳品蛋白质检测方法的缺陷，出现掺加尿素、 铵肥、 三聚氰胺等氮含量高的有机物来提高“蛋白质含量”的违法行为，严重制约了我国乳制品的质量提升，影响了消费者的健康。目前现行的乳品中蛋白质的检测方法[3]会受脂肪及碳水化合物等因素干扰，尤其该法对水解蛋白及动物蛋白等劣质蛋白具有相似的响应作用，同样为不法分子掺加劣质蛋白以提高蛋白质含量提供可乘之机。为此亟需建立适应新掺假情况的快速、 高效的真蛋白检测方法。

目前， 酪蛋白检测方法有凯氏定氮法[4]、 双缩脲法[5]、 四阶导数分光光度法[6]、 液质联用法[7]、 ELISA法[8]、 电泳法[9]、 蛋白质免疫印迹[10]、 反相色谱[11]、芯片[12]及荧光探针法[13]。但这些方法都具有不同程度的局限性，如灵敏度和选择性较差、检测仪器价格昂贵、操作过程复杂等。近来，Wang等[13]报道了基于BSPOTPE探针对酪蛋白胶团微环境极性的改变产生聚集诱导发光现象 （Aggregation induced emission， AIE），并建立了酪蛋白的检测方法，但探针只影响酪蛋白微环境的极性，并未与酪蛋白胶团发生结合作用。

本课题组报道了1，8萘酰亚胺类荧光探针与酪蛋白相互作用后的AIE特性[14～16]。本实验合成了新型双羧基水溶性1，8萘酰亚胺类荧光探针2，研究了酪蛋白对探针2的聚集诱导发光效应的机理，根据探针2对酪蛋白特异性的识别作用，建立了酪蛋白检测新方法并应用于实际奶粉中总酪蛋白含量的测定。本方法具有快速高效等特点，为乳品质量安全监测提供了重要信息。

2实验部分

2.1仪器和试剂

2.3光谱测定

以280 nm为激发波长，300～400 nm范围内测定酪蛋白内源荧光发射光谱；以300 nm为激发波长，在440～600 nm范围内测定探针2与酪蛋白体系发射光谱，入射和出射狭缝带宽均为5 nm。

3结果与讨论

3.1探针2与酪蛋白聚集诱导发光机理

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白质，约占总蛋白含量的80%，主要以胶团状态存在于乳品中，它是以含磷蛋白质为主体的几种蛋白质的复合体，主要分为αsl酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白4种[2]。其中αs1酪蛋白和αs2酪蛋白含有4个色氨酸残基， 包括Trp164， 199， 109和193； 而β酪蛋白和κ酪蛋白各自含有1个色氨酸残基， 分别为Trp143和176。除此之外， 酪蛋白还含有大量疏水性的酪氨酸残基。色氨酸和酪氨酸残基位于位于酪蛋白疏水腔第一和第二子域之间，对于酪蛋白胶团的自组装具有重要作用，同时也是酪蛋白在350 nm附近内源性荧光的主要体现基团[17]。作者设想探针2的双羧基作为前导嵌入式基团插入酪蛋白疏水腔中，与色氨酸和酪氨酸残基以非共价键作用，如疏水、氢键作用等相结合，导致未结合的氨基酸残基包埋在疏水腔中，使得酪蛋白胶团结构更加紧实；而1，8萘酰亚胺荧光基元则吸附于胶团表面导致探针分子的聚集，引起聚集诱导发光效应[18]。

以300 nm为激发波长，考察了酪蛋白对探针2荧光光谱的影响（pH 7.4），如图2A所示，随着酪蛋白浓度的增加，探针2在480 nm附近呈现显著的荧光增强并伴随最大发射峰蓝移；图2B为浓度为0～5.0 g/L的酪蛋白对探针2颜色的影响，随着酪蛋白浓度的增加，探针2的发光效应逐渐增强；结果表明，探针2与酪蛋白发生结合作用，形成新的发光复合物，并且复合物的疏水性随着酪蛋白浓度的增加而逐渐增大。

为了研究酪蛋白与探针2的荧光增强机理，考察了不同浓度探针2对酪蛋白荧光及吸收光谱的影响（pH 7.4），酪蛋白的内源性荧光主要由色氨酸和酪氨酸体现，如图3A所示，当激发波长为280 nm时，酪蛋白在350 nm附近呈现特征荧光峰，探针2在395 nm处呈微弱荧光，随着探针2浓度的增加，酪蛋白荧光被逐渐猝灭并伴随显著的蓝移；同时在475 nm附近出现新的发射峰，且光强逐渐增大，发射峰向短波长方向移动。结果表明，探针2与酪蛋白发生结合作用，酪蛋白中的色氨酸和酪氨酸残基发色团的疏水性增加，包埋进疏水腔中；而450 nm附近新峰的出现表明形成了探针2酪蛋白复合物，且复合物的疏水性随着探针2浓度的增加而逐渐增大。此外在400 nm处出现的等吸收点表明酪蛋白从游离态向探针2的结合态转变。

摘要：建立高效快速、操作简便、价格低廉的乳品真蛋白检测方法具有重要意义。本实验合成了具有双羧基官能团的水溶性1，8萘酰亚胺荧光探针2，探针2对酪蛋白具有特异性发光效应，其机理是双羧基为前导嵌入基团插入酪蛋白胶团子域的疏水腔中，与色氨酸、酪氨酸等氨基酸残基以氢键及疏水作用相结合后使酪蛋白胶团结构收缩，萘酰亚胺荧光基元吸附于酪蛋白胶团表面呈现聚集诱导发光效应 （Aggregation induced emission， AIE）。以300 nm为激发波长，一定范围内探针2在480 nm附近处发光强度与酪蛋白浓度成正比，在pH 5.5条件下建立了酪蛋白AIE定量分析方法；线性范围为0.1～9.5 mg/L，检出限 （3σ）为2.9 mg/L，对不同浓度酪蛋白平行测定9次，相对标准偏差<3%；三聚氰胺、铵肥、尿素、乳清蛋白、血清蛋白、I型胶原蛋白及粗卵清蛋白等对于测定结果无显著影响（±5%），用于奶粉中总酪蛋白含量的测定结果与双缩脲法相一致。

关键词：1，8萘酰亚胺； 双羧基； 酪蛋白； 聚集诱导发光

1引言

乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白（包括乳白蛋白和乳球蛋白）及少量脂肪球膜蛋白，上述蛋白构成了乳中的“真蛋白”[1]。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白质，约占总蛋白量的80%，主要以胶团形式存在。酪蛋白是以磷蛋白质为主体的几种蛋白质的复合体，主要分为αsl酪蛋白、 αs2酪蛋白、 β酪蛋白和κ酪蛋白4种[2]。由于国标中乳品蛋白质检测方法的缺陷，出现掺加尿素、 铵肥、 三聚氰胺等氮含量高的有机物来提高“蛋白质含量”的违法行为，严重制约了我国乳制品的质量提升，影响了消费者的健康。目前现行的乳品中蛋白质的检测方法[3]会受脂肪及碳水化合物等因素干扰，尤其该法对水解蛋白及动物蛋白等劣质蛋白具有相似的响应作用，同样为不法分子掺加劣质蛋白以提高蛋白质含量提供可乘之机。为此亟需建立适应新掺假情况的快速、 高效的真蛋白检测方法。

目前， 酪蛋白检测方法有凯氏定氮法[4]、 双缩脲法[5]、 四阶导数分光光度法[6]、 液质联用法[7]、 ELISA法[8]、 电泳法[9]、 蛋白质免疫印迹[10]、 反相色谱[11]、芯片[12]及荧光探针法[13]。但这些方法都具有不同程度的局限性，如灵敏度和选择性较差、检测仪器价格昂贵、操作过程复杂等。近来，Wang等[13]报道了基于BSPOTPE探针对酪蛋白胶团微环境极性的改变产生聚集诱导发光现象 （Aggregation induced emission， AIE），并建立了酪蛋白的检测方法，但探针只影响酪蛋白微环境的极性，并未与酪蛋白胶团发生结合作用。

本课题组报道了1，8萘酰亚胺类荧光探针与酪蛋白相互作用后的AIE特性[14～16]。本实验合成了新型双羧基水溶性1，8萘酰亚胺类荧光探针2，研究了酪蛋白对探针2的聚集诱导发光效应的机理，根据探针2对酪蛋白特异性的识别作用，建立了酪蛋白检测新方法并应用于实际奶粉中总酪蛋白含量的测定。本方法具有快速高效等特点，为乳品质量安全监测提供了重要信息。

2实验部分

2.1仪器和试剂

2.3光谱测定

以280 nm为激发波长，300～400 nm范围内测定酪蛋白内源荧光发射光谱；以300 nm为激发波长，在440～600 nm范围内测定探针2与酪蛋白体系发射光谱，入射和出射狭缝带宽均为5 nm。

3结果与讨论

3.1探针2与酪蛋白聚集诱导发光机理

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白质，约占总蛋白含量的80%，主要以胶团状态存在于乳品中，它是以含磷蛋白质为主体的几种蛋白质的复合体，主要分为αsl酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白4种[2]。其中αs1酪蛋白和αs2酪蛋白含有4个色氨酸残基， 包括Trp164， 199， 109和193； 而β酪蛋白和κ酪蛋白各自含有1个色氨酸残基， 分别为Trp143和176。除此之外， 酪蛋白还含有大量疏水性的酪氨酸残基。色氨酸和酪氨酸残基位于位于酪蛋白疏水腔第一和第二子域之间，对于酪蛋白胶团的自组装具有重要作用，同时也是酪蛋白在350 nm附近内源性荧光的主要体现基团[17]。作者设想探针2的双羧基作为前导嵌入式基团插入酪蛋白疏水腔中，与色氨酸和酪氨酸残基以非共价键作用，如疏水、氢键作用等相结合，导致未结合的氨基酸残基包埋在疏水腔中，使得酪蛋白胶团结构更加紧实；而1，8萘酰亚胺荧光基元则吸附于胶团表面导致探针分子的聚集，引起聚集诱导发光效应[18]。

以300 nm为激发波长，考察了酪蛋白对探针2荧光光谱的影响（pH 7.4），如图2A所示，随着酪蛋白浓度的增加，探针2在480 nm附近呈现显著的荧光增强并伴随最大发射峰蓝移；图2B为浓度为0～5.0 g/L的酪蛋白对探针2颜色的影响，随着酪蛋白浓度的增加，探针2的发光效应逐渐增强；结果表明，探针2与酪蛋白发生结合作用，形成新的发光复合物，并且复合物的疏水性随着酪蛋白浓度的增加而逐渐增大。

为了研究酪蛋白与探针2的荧光增强机理，考察了不同浓度探针2对酪蛋白荧光及吸收光谱的影响（pH 7.4），酪蛋白的内源性荧光主要由色氨酸和酪氨酸体现，如图3A所示，当激发波长为280 nm时，酪蛋白在350 nm附近呈现特征荧光峰，探针2在395 nm处呈微弱荧光，随着探针2浓度的增加，酪蛋白荧光被逐渐猝灭并伴随显著的蓝移；同时在475 nm附近出现新的发射峰，且光强逐渐增大，发射峰向短波长方向移动。结果表明，探针2与酪蛋白发生结合作用，酪蛋白中的色氨酸和酪氨酸残基发色团的疏水性增加，包埋进疏水腔中；而450 nm附近新峰的出现表明形成了探针2酪蛋白复合物，且复合物的疏水性随着探针2浓度的增加而逐渐增大。此外在400 nm处出现的等吸收点表明酪蛋白从游离态向探针2的结合态转变。