木霉菌对植物寄生线虫防治作用机制

王秀娟，张树武，徐秉良

（甘肃农业大学植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070）

植物寄生线虫（Plant-parasitic nematodes，PPNs）是引起植物病害的一类重要经济类有害生物[1,2]。据估计，全球农业生产中因其危害造成的经济损失每年高达1570亿美元[3]。植物寄生线虫引起的线虫病已成为我国主要的农业病害之一，严重阻碍我国粮食、经济作物安全生产。长期以来，施用化学杀线虫剂一直是防治植物线虫病害的主要措施，然而大量施用化学药剂不仅会使线虫产生抗药性，还会造成严重的环境污染问题并危害人体健康，进而导致大多数高毒类杀线剂已被禁用或限制使用[4]。同时，随着人们绿色环保意识的提高和无公害生产的要求，生物防治因能有效减少化学农药的使用并减轻环境污染已逐渐成为植物寄生线虫病安全有效的防治措施。

木霉菌Trichodermaspp.是一类广泛分布于土壤中的有益菌，因在线虫病防治中极具生防潜力而被广泛研究[1,2,4-6]。近年来，木霉对植物线虫病的防治机理已成为木霉生防研究中的重要科学问题。本文主要从木霉防治线虫病的直接和间接生防机制的视角，综述了木霉对线虫的重寄生作用、毒杀作用及其对植物的诱导抗性和促生作用等多种协同防治植物病原线虫病的机制，以期为进一步深入研究生防木霉菌防治植物线虫病提供新思路。

1 木霉菌防治线虫的直接作用机制

1.1 木霉菌重寄生作用

木霉菌通过重寄生作用进行识别、接触、缠绕和穿透线虫来抑制或溶解寄主体壁，是木霉最重要、最广泛的生防机制之一[7]。研究表明，木霉菌胞外酶在木霉菌重寄生作用过程扮演着重要的作用，如其在重寄生过程中分泌几丁质酶、蛋白酶、葡聚糖酶等一系列水解酶来消解线虫孢囊、卵、体壁，其中以几丁质酶和蛋白酶尤为重要[1,2,7-9]。目前，已发现哈茨木霉T.harzianum[10]、康宁木霉T.koningiopsis[11]、绿色木霉T.viride[6]和长枝木霉T.longibrachiatum[1]等菌株可以有效抑制根结线虫的繁殖，本课题组前期分离筛选出适宜于西部干旱生态环境条件下的具有自主知识产权的一株长枝木霉T6杀线菌株，并发现其对禾谷孢囊线虫Heteroderaavenae孢囊、卵和幼虫均具有较强的寄生和致死作用，利用显微镜观察发现其寄生后能够导致孢囊、卵和线虫体壁破裂和溶解[2,4,12]，进一步研究发现其能够通过提高和分泌大量几丁质酶和蛋白酶导致孢囊体壁和卵壳溶解，以及能够分泌蛋白酶导致南方根结线虫Meloidogyneincognita幼虫体壁溶解和线虫死亡[1]。

1.1.1 木霉菌几丁质酶杀线作用及机理 几丁质酶是木霉菌胞外酶的重要组成成分之一，主要由内切几丁质酶（Endochitinase）和外切几丁质酶（Exochitinase）组成，其在重寄生线虫过程中发挥着重要的杀线功能。木霉菌分泌的几丁质酶在线虫寄生和致死作用中已有相关研究，Sahebani等[10]报道爪哇根结线虫M.javanica卵能够诱导哈茨木霉BI几丁质酶活性的升高，进而提高其侵染卵的活力。Baldoni等[11]从51株分离的真菌中筛选出康宁木霉UFSMQ40具有较好的杀线活性，通过以胶体几丁质作为诱导剂提取的几丁质酶发酵液对南方根结线虫、爪哇根结线虫有较高的致死率。Szabo等[13]研究表明，18株木霉菌株中有5株木霉菌对植物寄生线虫具有较强的寄生作用，其中哈茨木霉SZMC 1647对植物寄生线虫卵具有较强的寄生作用，进一步利用实时荧光定量PCR分析哈茨木霉SZMC 1647几丁质酶基因chi18-5（chit42）和chi18-12（chit33）的表达量发现，chi18-5（chit42）和chi18-12（chit33）在不同时间点存在较明显的表达量差异，但总体而言，哈茨木霉与线虫互作过程中几丁质酶基因高表达，表明哈茨木霉与线虫互作过程中，线虫卵可能诱导哈茨木霉几丁质酶基因chi18-5（chit42）和chi18-12（chit33）显著上调表达，进一步调控其产几丁质酶的能力增强，从而促进线虫卵体壁溶解。然而，有关chi18-5（chit42）和chi18-12（chit33）基因的具体功能还有待后期进一步验证。朱玉婷等[14]从烟草南方根结线虫卵中分离到 1株可产几丁质酶的长枝木霉HBF1，从菌株HBF1中克隆到1个几丁质酶基因，命名为TlChi46，初步预测该基因编码氨基酸的个数、理论分子量及等电点分别为423个、45.9 kDa、5.23，通过构建TlChi46与昆虫寄生菌几丁质酶基因的进化树明确了二者亲缘关系可能相对较远，该基因能否合成几丁质酶并杀死线虫仍待进一步验证。

1.1.2 木霉菌蛋白酶杀线作用及机理 木霉菌胞外蛋白酶是另一类重要的细胞壁降解酶，对植物病原线虫的生物防治也有着重要作用，木霉与植物病原线虫互作时，木霉分泌的蛋白酶能失活钝化寄主线虫体壁，降解病原线虫体壁中蛋白质组分等途径，与其他细胞壁降解酶协同发挥对线虫的致死作用[3,15]。Geremia等[16]从哈茨木霉IMI206040中分离到一种碱性丝氨酸蛋白酶Prb1，分子量31 kD，等电点9.2。随着分子生物技术水平的飞速发展，编码木霉菌蛋白酶prb1基因已克隆，同时过表达prb1基因的突变体能够增强木霉菌的生防功能[17]。另有研究表明，哈茨木霉能够毒杀南方根结线虫2龄幼虫，并且过表达碱性丝氨酸蛋白酶prb1基因的哈茨木霉转化菌株对南方根结线虫的毒杀作用显著增强[18]。另外，Suarez等[19]从哈茨木霉CECT2413菌株中发现1种蛋白酶PRA1，其功能与胰蛋白酶类似，该发酵蛋白粗提液显著降低了线虫卵的孵化率。Stleger等[20]研究表明，微生物胞外蛋白酶是大部分虫生真菌侵染初期产生的唯一胞外酶，而几丁质酶则是侵染后期产生的最主要胞外酶。Chen等[21]从拟康宁木霉T.pseudokoningiiSMF2中分离到1种线虫体壁降解酶-丝氨酸蛋白酶（Cuticle-degrading serine protease）SprT，该酶对根结线虫卵的孵化率表现为显著降低，并且对线虫2龄幼虫表现出较强的毒杀作用。另外，天冬氨酸蛋白酶在木霉菌重寄生和植物共生作用中也发挥着重要作用[22]。Szabó等[23]通过测定哈茨木霉与线虫卵互作中的 13个肽酶编码基因的表达水平，发现酸性丝氨酸蛋白酶pra1、天冬氨酸蛋白酶p6281和p9438、金属内肽酶p7455和丝氨酸蛋白酶p5216均高表达，这预示着哈茨木霉蛋白酶基因pra1、p6281、p9438、p7455和p5216可能在与卵互作过程中发挥着关键杀线作用。

1.2 木霉菌毒杀作用

毒杀作用是木霉防治线虫的另一种重要的直接生防机制，在木霉菌生长过程中，产生多种具有毒杀活性的次级代谢产物，这些毒杀性的代谢产物能够杀死线虫[24]，达到防治植物病原线虫病的目的。目前已报道的具有杀线活性的木霉菌主要有长枝木霉、绿色木霉、哈茨木霉、钩状木霉T.hamatum、深绿木霉T.atroviride及康宁木霉[24-31]。Zhang等[32]采用响应面法来优化长枝木霉T6的杀线发酵液的条件，结果表明，T6培养滤液在初始pH为6.06、接种量为1.62 mL、培养时间为7.15 d的发酵条件下杀线虫活性最高，达92.42%，温室试验中T6培养滤液在小麦播种后70 d的生防效果为83.88%。Yang等[33]对所分离的329株木霉菌株进行了毒杀全齿复合线虫测定，结果表明其中 15株木霉菌对全齿复合线虫具有较强的毒杀活性。目前已发现木霉所产生的毒杀物质分为两类，一类是小分子和易挥发性物质，包括芳香族化合物、聚酮化合物、丁烯酸内酯类及萜烯类等[34,35]；另一类是大分子代谢产物，包括肽 Peptailbols、酶类等[36]。已有报道表明目前从木霉菌中分离的杀线物质主要有木霉菌素[32]、乙酸[24]、胶酶毒素[37]和肽环孢菌素 A[38]等成分；同时，梁志怀等[39]利用GC-MS检测和分析了木霉菌TUV-13菌株杀线活性成分，共获得40多种化学成分，其中主要以烷烃类成分的种类最多，另外还包含有机酸类、酯类、酮类和类固醇类等有机化合物。

综上，木霉菌发挥生物防治的功能主要为重寄生作用和毒杀作用，其主要机制为木霉菌在生长过程中分泌的胞外酶和次级代谢产物来协同发挥生物防治的功能[40,41]。

2 木霉菌防治线虫的间接作用机制

早期对木霉生防机制的研究主要集中在木霉与寄生线虫之间的直接作用，而对于木霉与寄主植物相互作用增强植物抗病性的研究较少。近年来，研究人员发现木霉菌可以通过诱导植物防御系统与植物建立共生关系，增强植物对线虫病的抗性，该机制称为木霉诱导的植物系统抗性[42-44]；另外，木霉菌与植物相互作用、相互共存和互利共生，木霉菌能够加速植物吸收土壤中的养分，从而促进植物生长，增强植物抵抗逆境胁迫的能力，这便是木霉菌防治线虫病的间接作用机制。

2.1 木霉菌诱导植物增强抗病性

Harman等[45]发现木霉是一种机会性的内生真菌，可定殖于土壤中的植物根部，诱导植物抗病反应。木霉菌定殖于植物根系后，水杨酸（Sacyclic acid，SA）和茉莉酸（Jasmonic acid，JA）通路均发挥着重要的防御作用[46]。Martínez-Medina等[47]发现当哈茨木霉T-78菌株定殖于番茄植株根际后，可通过诱导番茄植株SA和JA来增强对根结线虫的抗性。另外，木霉也能够诱导植物活性氧信号来增强对线虫的抗性，如深绿木霉诱导番茄产生活性氧可能是番茄生长过程中的防御根结线虫的主要机制[48]。木霉在植物根部定殖，可增加植物体内与防御相关酶和化合物的合成或积累，如过氧化物酶（Peroxidase，POD）、苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等，从而诱导植物对线虫的防御反应[49]。Zhang等[2]研究发现小麦接种长枝木霉T6菌株和禾谷孢囊线虫卵后，小麦抗病相关酶（几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶）活性增加，这可能是T6抗小麦孢囊线虫病的主要机制。Gupta等[50]发现哈茨木霉可作为生物接种剂对洋甘菊总酚和黄酮含量具有显著的诱导，进而抵抗对根结线虫的侵染。木霉在定殖植物过程中能刺激植物产生胞壁沉积物，可不同程度地阻止线虫侵入[51]。总之，木霉制剂施用到植物根际土壤后定殖于植物根部，通过SA、JA通路和活性氧信号来诱导植物增强抗线虫病的能力，同时，其还可通过增强植物根部的细胞壁来抵御线虫。

2.2 促生作用

研究表明，木霉菌对辣椒、马铃薯、番茄、黄瓜、白菜、香蕉、草莓和小麦等多种作物具有促生作用[52,53]，如哈茨木霉菌株T-22能显著促进玉米、大豆、长春花等植物生长[52]；拟康宁木霉菌株Th003能显著提高番茄种子的萌发率[54]；棘孢木霉T.asperellumDQ-1分生孢子粉能显著促进黄瓜、辣椒、番茄等幼苗生长[55]；桔绿木霉T.citrinoviride不仅能有效防治根结线虫，还能显著增加番茄植株的生物量[56]；长枝木霉T6能显著促进小麦种子萌发和幼苗生长，增加幼苗地上部分和根的重量[57]。朱佳芯等[58]从海南土壤中筛选出4株耐热木霉菌株，其中桔绿木霉不仅能改善土壤养分，而且对热区香蕉增产有显著的影响；赵玳琳等[59]研究表明棘孢木霉 GYSW-6m1能显著提高草莓的株高、根长、植株总鲜重和植株总干重。近年来，众多学者关于对木霉菌的促生机制方面开展了相关研究，有学者研究发现，木霉对植物的促生机制具有多元性的特点，木霉制剂施入土壤后产生有机酸，这种有机酸会促使土壤中难溶的植物必需的微量元素进一步溶解，进而植物可通过吸收溶解的微量元素促进植物生长[45]；哈茨木霉T22既有溶解可溶性或微溶性矿物质的能力，还能通过鳌合或降解作用来溶解土壤中金属氧化物的能力，最终可溶解二氧化锰（MnO2）、锌（Zn）、铁（Fe）和硫酸钙（CaSO4），从而促进植物根系对土壤中矿物质的吸收，以发挥促生作用[60]。绿色木霉对拟南芥的促生作用主要表现为可促进生物量的增加和侧根的发育[61]。Bharti等[62]研究表明哈茨木霉通过三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle，TCA）以及戊糖磷酸途径（Hexose Monophosphate Pathway，HMP）对番茄发挥促生功能。上述研究证明了木霉直接定殖植物根部后发挥的促生作用，另有研究表明，木霉菌在生长过程中能散发出挥发性的有机物质，这些物质同样能够促进植物生长，如挥发性有机物质6-戊基-2H-吡喃-2-酮（6-pentyl-2H-pyran-2-one，6PP）可显著促进拟南芥生长[63]。在密闭条件下，将深绿木霉与拟南芥共培养但不直接接触，拟南芥的鲜重和叶绿素含量显著增加[64]。综上所述，木霉菌不仅能够直接拮抗植物病原线虫，还能定殖于植物根部，通过诱导植物产生抗病性和促进植物生长来间接防治植物线虫病。

3 木霉防治线虫病存在的问题及展望

3.1 加大对杀线木霉种类调查和挖掘

近年来，科研工作者发现了许多具有杀线虫作用的木霉菌，虽在前人研究的基础上开展了很多探索性的工作，但对有杀线潜力的木霉种类挖掘还不够，这就要求科研工作者利用大自然广泛的微生物资源，充分调查和挖掘具有杀线虫作用的木霉种类，将更多的木霉菌资源有效地应用于线虫防治，以开拓我国线虫生物防治的新领域。

3.2 明确杀线木霉对植物寄生线虫的毒杀机制

迄今为止，已发现木霉次级代谢产物能有效杀死线虫，然而，已发现具有杀线虫作用的木霉次级代谢产物种类较少。另外，关于木霉次级代谢产物中有效的杀线活性物质如何杀死线虫，其作用机理尚不明晰。因而，国内外科研工作者有待于更深入、更系统地探明木霉代谢产物防治线虫的机制，以期更好地发挥生防木霉的杀线作用。

3.3 揭示木霉防治线虫的分子作用机制

木霉防治植物线虫病的机制包括重寄生、毒杀作用及诱导植物产生系统抗性、促进植物生长等多种机制，田间防治中木霉往往以多种机制协同发挥防效作用。因而，明确木霉防治线虫病的机制是科学应用木霉防治线虫病的关键。近年来，众多科研工作者已从木霉菌种、胞外酶、次级代谢物质的分离鉴定等方面开展了木霉防治线虫的研究，然而，在木霉胞外酶、次级代谢产物的种类以及调控其合成的基因、木霉诱导植物产生抗病性的机制还需要更深入的研究。随着分子生物学的不断发展，基于基因组、转录组、蛋白组、代谢组学技术对于挖掘木霉胞外酶、次级代谢产物的种类以及调控其合成的基因、以及开展木霉诱导植物产生抗病性机制的研究工作，可为木霉的田间应用提供更多的理论依据。