姜瘟病生防菌幼套近明球囊霉N62的筛选鉴定

汪 茜，李冬萍，覃晓娟，车江旅，宋 娟*，陈廷速*

（1.广西农业科学院微生物研究所，南宁 530007；2.广西农业科学院，南宁 530007）

姜瘟病，又称姜腐烂病，是由青枯劳尔氏菌Ralstoniasolanacearum（R.S）侵染所致[1]。姜瘟病是生姜ZingiberofficinaleRoscoe生产中经常发生的病害，一般病田发病率为10%～30%，重症田高达90%以上，甚至全田枯死，种姜全部腐烂[2]，经济损失巨大，严重制约了生姜产业的持续健康发展。由于该病为土壤传播，常规化学药剂很难在土壤中起到持续控病作用；采用作物轮作的方式虽然可以减轻姜瘟病的发生，但需要较长的轮作周期才能达到较好的防病效果。随着生物防治技术在作物土传病害防治中的发展与应用，利用生防微生物防治姜瘟病将是可供选择的一条有效防控途径。丛枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）真菌能与植物根系形成互惠共生体，在植物根际形成庞大的菌丝网络系统，目前90%以上的陆地植物都能形成丛枝菌根[3]。AM真菌能够促进宿主植物吸收水分和营养物质[4,5]，减少植物病害，提高植物抗病性，改善土壤生态，修复退化土壤，保证甚至促进植物在逆境中的生长发育[6-8]。李应德等[9]研究发现，接种摩西球囊霉Glomusmosseae可抑制烟色织孢霉Microdochiumtabacinum对紫花苜蓿Medicagosativa的侵染危害，降低根腐病发病率。王维华等[10]研究结果表明接种AM真菌能显著增加生姜植株的株高、分枝数、单株叶面积、根茎产量，提高经济系数和叶片中叶绿素含量。随着生育期的延长，生姜植株对AM真菌的依赖性增大。刘贵猛等[11]研究发现，AM真菌地表球囊霉Glomusversiforme与植物根际促生细菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）假单胞菌S3-11菌株组合能够相互促进、协同抑制生姜青枯病菌、诱导生姜抗病性、促进生姜生产和增加产量。目前，利用AM真菌防治姜瘟病的研究报道较少，可利用的菌株数量不多。为了进一步发掘姜瘟病的生防菌资源，本研究从生姜根际土壤中分离筛选出 1 株对青枯劳尔氏菌具有明显促生及防治效果的生防AM真菌。通过形态学及18S rDNA分子生物学相结合将其鉴定为幼套近明球囊霉，以期为姜瘟病的生物防治提供新的菌种资源，也为后续抗病菌剂菌肥的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试AM真菌菌株N62、LC39-10、GZ-10、FS-1-74由本实验室分离保存；生姜（ZingiberofficinaleRoscoe）组培苗由本实验室培育；姜瘟病病原菌为青枯劳尔氏菌Ralstoniasolanacearum，分离菌株Gg06，由广西大学农学院惠赠，分离自百色生姜根际土壤。

1.2 病原菌及菌剂制备

病原菌制备：将病原菌转接于NA液体培养基中，30 ℃、120 r/min振荡培养48 h，制备菌液，用无菌水调整菌液浓度至1×108cfu/mL，备用。

AM菌剂制备：以玉米为宿主，将AM菌株的孢子接种于玉米幼苗根系，种植于以河沙:沸石=3:1（河沙粒径≤2 mm，沸石粒径2 mm）于121℃高压蒸汽灭菌2 h的培养基质中进行盆栽（种植盆规格为206 mm×175 mm×150 mm），每盆种植3～5株玉米。光照培养12～16周；每周浇50% Hoagland营养液；培养12～16周后除去茎秆，保留玉米根系以及培养基质中含有的AM真菌菌丝、孢子即为AM真菌菌剂。

1.3 菌株对生姜生长影响的测定

盆栽试验基质为灭菌的河沙，将基质放于塑料盆底部（占体积1/3），取4叶期大小的生姜组培苗，放置于盆中央，然后将接上述制备好的AM菌剂均匀洒于姜苗根系附近，每盆100 g，最后覆盖2～3 cm厚的基质，用自来水浇透。每个处理重复5盆，以不接种AM菌剂处理为对照。45 d后取每个处理的部分根系做AM真菌根系侵染试验，3个月后测定生姜苗的株高、叶片数、鲜重和干重。

1.4 菌株的定殖检测

将根系清洗干净剪成2 cm长，加20% KOH溶液完全浸泡根系，90 ℃水浴10 min后用自来水轻轻冲洗3次。用碱性 H2O2脱色60 min，用自来水冲洗3次。加5%乙酸溶液室温酸化5 min，去掉乙酸溶液，用自来水轻轻冲洗3次。再用5%的墨水醋染液（Quink牌纯黑墨水）在66 ℃水浴染色30 min，然后用清水浸泡（12 h）脱色后即可镜检[12]。以PVLG为浮载剂将染色根段压成显微制片。在200×显微镜下观察染色根段中的AM真菌侵染结构，并利用十字交叉法[13]测定AM真菌总定殖率。

1.5 菌株对姜瘟病的防治效果测定

温室试验中，测定AM菌剂对姜瘟病的防效作用。基质为灭过菌的河沙，按照1.3描述的方法接种AM菌剂，1周之后每株生姜苗浇取25 mL的青枯菌菌液灌根处理，其浓度为l×108cfu/mL，以不接菌根真菌的处理为对照，每个处理5盆。7 d后调查叶片发病情况[14]，病情分级标准：0级，无症状；，1%～25%的叶片出现萎蔫症状；2级，全株26%～50%的叶片出现萎蔫症状；3级，全株51%～75%的叶片出现萎蔫；4级，全株76%～100%的叶片出现萎蔫症状。计算病情指数和防效，病情指数＝Σ（病级数×该病级植株数）/（最大病级数×植株总株数）×100，防治效果（%）＝（对照组病情指数－处理组病情指数）/对照病情指数×100。

1.6 生防菌株的分类鉴定

1.6.1 形态学鉴定 取20 g土样用湿筛倾注-蔗糖离心法，筛取孢子，在体视镜下先观察记录孢子的颜色、大小、连孢菌丝的特征、孢子果形态等。在此基础上，用毛细吸管挑取新鲜的AM真菌孢子置于载玻片上，加浮载剂（水、乳酸、乳酸甘油、PVLG）后，在Nikon E-600显微镜下观察，记录孢子的形状、大小、颜色、表面纹饰，孢子内含物、连孢菌丝的数目、宽度及形状、孢壁结构、辅助细胞（土生泡囊）、外生菌丝及附属结构产孢子囊等特征；同时辅助使用Melzer′s试剂、棉兰试剂，观察孢子的特异反应，对有代表性或特异性的特征进行拍照。根据孢子的形态特征，采用Schüßler和Walker[15]的分类系统，并参阅王幼珊和刘润进[16]“球囊菌门丛枝菌根真菌最新分类系统菌种名录”和相关网站：http://invam.caf.wvu.edu（INVAM，West Virginia University，USA）；http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Taxonomy.html（Department of Plant Pathology，University of Agriculture in Szczecin，Poland）及 http://www.lrz.de/～schuessler/amphylo/amphylogeny.html的鉴定资料以及近几年发表新种的原始描述，进行种属的检索、鉴定。AM真菌孢子以Melzer′s:PVLG = 1:1或PVLG为浮载剂制成玻片标本，密封、编号并进行贮藏。

1.6.2 分子鉴定 对AM真菌孢子进行表面消毒，用移液枪挑取孢子至1.5 mL离心管中，加无菌水清洗，放入超声波处理3～5次后，加入2%（w/v）氯胺T+2滴吐温20，保证消毒液没过孢子，摇晃10 min，用无菌水冲洗3～5次后，加入200 mg/L链霉素+100 mg/L硫酸庆大霉素混合消毒液，摇晃浸泡10 min后，用无菌水冲洗3～5次，静置20 min后于4 ℃保存备用[17]。

依据董秀丽和赵斌[18]描述的方法对AM真菌单孢DNA提取，即用移液枪吸取单个AM真菌孢子，用无菌水漂洗5次后，将其放入无菌的1.5 mL离心管中，加入40 μL TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0），将其充分破碎后，加入10 μL 20% Chelex-100，以减少金属离子对DNA的影响。沸水浴10 min，冰浴1～2 min，15000 r/min离心5 min，吸取上清液到新的离心管中，置于-20 ℃保存，备用。

将AM真菌单孢DNA作为第一次PCR扩增模板，将第一次PCR扩增产物稀释100倍后作为第二次PCR扩增模板，进行nested-PCR。第1次PCR扩增采用真菌18S rDNA通用引物GeoA2（5′-CCAGTAGT CATATGCTTGTCTC-3′）和 Geo11（5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′）[19]，反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸100 s，循环30次，最后 72 ℃延伸 10 min，扩增片段的大小约1800 bp；第2次 PCR 扩增采用AM真菌特异性引物NS31（5′-TTGGAGGGCAAGTCTGG TGCC-3′）和 AML2（5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3′），扩增片段的大小约 550 bp，模板以第一次PCR产物稀释100倍，取2 μL，反应体系与第一次PCR相同，反应程序退火温度改为50 ℃，延长时间为50 s，其余反应程序与第一次相同。取扩增产物 2 μL，用1.2%琼脂凝胶电泳检测。产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.7 数据统计与分析

采用 SPSS 18.0 软件分析进行组件均值数据的One-way ANOVA差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 接种菌株对生姜生长的影响

接种AM真菌菌株可有效促进生姜植株的生长，植株的株高、叶片数、鲜重和干重的增长幅度分别为6.04%～30.2%、23.9%～43.5%、22.1%～54.7%、16.3%～71.9%，其中接种N62后生姜植株生长健壮，未出现各种病害症状，该处理株高、茎径、鲜重和干重均比对照显著增加（表1）。

表1 不同AM真菌菌株对生姜组培苗生长的影响Table 1 The effect of different AM fungi on ginger growth

2.2 AM真菌在生姜根系中的定殖

生姜组培苗接种AM真菌菌株40 d后，对生姜根系染色进行显微镜观察。4株AM真菌菌株的定殖率为27.7%～53.5%，其中N62、LC39-10、GZ-10的定殖率较高，但相互间差异不显著，菌株 FS-1-74的定殖率最低（图1）。接种菌株N62的生姜根段中有AM真菌的孢子、泡囊及菌丝的典型结构，空白对照中未见菌丝体定殖（图2）。

图1 不同AM真菌菌株的定殖率Fig.1 The colonization rate in ginger roots with different AM fungi

图2 生姜根系AM真菌侵染情况Fig.2 The colonization of AM fungi in ginger roots

2.3 AM真菌对姜瘟病的防治效果

生姜接种AM真菌处理对姜瘟病产生了强弱不一的防治效果，盆栽防效为16.8%～58.6%，其中菌株N62处理的生姜植株表现的防治效果最佳，显著高于其他处理（图3，4）。

图3 不同AM真菌菌株对姜瘟病的防治效果Fig.3 The effect of inhibition ginger wilt with different AM fungi

图4 菌株N62对姜瘟病的防治效果Fig.4 The effect of strain N62 on ginger wilt

2.4 菌株N62的分类鉴定

菌株N62孢子在土壤中单生，球形或近球形，黄至黄棕色，直径80.0～140.0 μm（图5A）。孢子壁：2层。外层无色透明，表面不均匀，厚1.0～3.0 μm（图5B）；外层在成熟孢子中脱落，有时只剩部分残屑，在Melzer’s试剂反应中呈粉红色（图5C），在棉兰试剂反应中呈浅蓝色（图 5D）。内层厚3.0～6.0 μm。由多层薄壁组成，淡黄色至淡黄棕色层状壁。连孢菌丝：圆筒状至小喇叭状，无色透明，宽3.0～6.0 μm，孢子成熟后即萎缩脱落。连点孔宽7～10 μm，两层壁，成熟孢子外层常脱落，内层与孢子壁内层连接，有一个由内壁形成的隔封闭连点（图5E）。

图5 菌株N62形态鉴定Fig.5 Morphological characteristics of strain N62

对菌株N62的18S rDNA序列进行PCR扩增，产物经纯化后测序，得到的片段长度为550个碱基序列（GenBank登录号：MT378291）。对该菌株的18S rDNA序列用Blast软件与GenBank中已有序列进行同源性比较，结果发现其与幼套近明球囊霉Claroideoglomusetunicatum有98%的最大同源性。用软件MEGA version 7.0将菌株N62与来自GenBank的16株真菌一起构建基于18S rDNA序列的系统发育树（图6）结果显示：16株真菌划分为2个类群，属于AM真菌的12株真菌在100% boostrap水平上聚一群，不属于AM真菌的3个菌株另聚一群，菌株N62则与近明球囊霉属Cladosporium中的幼套近明球囊霉（MN726591和MN726593）聚为一支，同源性为97%。菌株N62的形态学与幼套近明球囊霉相符，结合基于18S rDNA序列的系统发育树分析结果，将菌株N62鉴定为幼套近明球囊霉。

图6 基于18S rDNA序列同源性的菌株N62的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree based on 18S rDNA sequence homology of strain N62 with the related bacteria derived from GenBank database

3 讨论

AM真菌鉴定是菌根研究的基础，其对保护菌种多样性，促进AM真菌在农业生产上应用具有重要意义。目前，AM真菌的鉴定主要使用孢子形态鉴定和分子鉴定两种方法。孢子的形态鉴定存在分离过程繁琐和鉴定难度较高等问题，分子鉴定具有较高的稳定性，并可以对样本中的菌丝体进行鉴定。本研究通过形态学特征分析，结合18S rDNA 基因序列的比对和系统发育树构建，将分离得到的菌株N62鉴定为幼套近明球囊霉。并已向中国普通微生物菌种保藏管理中心申请菌种专利保藏，编号为CGMCC No.17987。

姜瘟病已成为影响生姜产量和品质的最主要因素，现主要采用农用硫酸链霉素等抗生素浸种或氯化苦等化学农药土壤消毒，但极易导致病原菌产生抗药性和环境污染。生产上也常采用抗病品种和轮作套种的方式来进行防治，但效果均不理想[20]。充分挖掘自然生态系统中共生微生物的促生和抗病潜力，提高我国生姜的生产能力，保护和改善姜地的生态环境，对促进我国生姜产业的可持续发展具有重要意义。目前，国内外研究学者对姜瘟病的生物防治研究中涉及的主要生防微生物为木霉和芽胞杆菌等真菌、细菌和放线菌有益微生物[21-23]，但这些生防微生物大多只定殖在生姜根际土壤中，受土壤微生态环境因子的影响较大，导致田间的生防效果不稳定，很难大面积推广，亟待发掘生防效果稳定的新型生防微生物。由于AM真菌能够通过定殖于植物根系内并与宿主形成互惠的共生体，其相对于完全暴露在根际土壤中的其他生防微生物受到环境的影响相对较小[24,25]，更容易获得稳定的防治效果。本研究中所接种的4株AM真菌菌株有效提高了生姜幼苗的株高、叶片数、鲜重和干重，不同程度地促进了生姜的生长，与前人的研究结果一致[10]。盆栽试验评价其对姜瘟病的防治效果，结果显示生姜接种 AM 真菌处理对姜瘟病产生了强弱不一的防治效果，其中幼套近明球囊霉 N62处理的生姜植株表现的防治效果显著优于其他菌株，盆栽防治效果为58.6%，防效相对稳定，但田间的防治效果仍需进一步的田间评价。前人研究发现，接种幼套球囊霉显著降低黄瓜枯萎病病情指数和发病率，根际真菌减少，细菌增多，降低了病原菌侵害宿主的机率[26]，本研究的幼套近明球囊霉 N62也能显著降低姜瘟病病情指数和发病率，下一步将深入研究接种幼套近明球囊霉N62对生姜植株根际土壤微生物群落的变化，揭示其抗病机制。

在开展生姜根系AM真菌侵染与姜青枯菌关系研究中，观察到同一生姜根内同时着生有AM真菌和深色有隔内生真菌（dark septate endophytes，DSE）结构（图2C），DSE是一类能与寄主植物互惠共生的微生物，其定殖宿主具有非专一性，且在逆境环境中，DSE也分布广泛，可能具有与菌根真菌相似生态学功能[27,28]。关于DSE在生姜生长过程中的生态学功能，以及DSE与AM真菌之间的相互关系还待进一步的研究。

田间条件下单靠AM真菌或PGPR对于植物病害往往难以达到理想的防治效果。为此，人们试图以与AM真菌常常共生的PGPR来加强AM真菌的生防功能，因为一定种类的AM真菌与PGPR的适当搭配组合能相互促进对方的定殖并协同发挥生理生态作用。刘贵猛等[11]发现AM真菌地表球囊霉Glomusversiforme与PGPR假单胞菌S3-11菌株组合能够通过相互促进对方的侵染与定殖，协同抑制生姜青枯病菌的繁殖和侵染，诱导植物合成防御性酶并提高其活性，进而改善植物的抗病性、降低危害程度。本研究中菌株N62也有类似的功能，但是单菌株抗姜瘟病的机制与混合菌株的抗病机制是否一致还有待进一步验证。