泰安市“香野”草莓采后主要病原菌的分离鉴定及精油抑菌效果评价

姜莉莉，孙守民，宗晓娟，孙瑞红，王晓芳，武 冲*

（1.山东省果树研究所/山东省现代设施果树技术创新中心，泰安 271000；2.山东农业大学植物保护学院，泰安 271018）

草莓FragariaananassaDuch.属蔷薇科草莓属多年生草本植物，其果实汁多味美、营养价值高，深受消费者喜爱，素有“水果之王”的美誉[1]。草莓货架期较短，采后腐烂是影响其品质和贮藏性状的重要因素。目前的草莓保鲜技术主要包括气调、可食涂膜、辐照等[2]。气调贮藏可以降低果实呼吸速率、减少营养物质消耗，从而达到延长货架期的目的。然而，不同品种草莓对CO2的耐受能力不同，气体浓度比例不合适，反而会引起品质劣化等不良反应[3]。可食涂膜技术是以可食性物质为原料，形成半透性薄膜，封闭草莓表面，降低草莓呼吸强度，防止微生物侵入[4]。辐照处理能够使草莓果实维持较高的总酚、黄酮及花色苷类物质的含量，抑制贮藏期间腐烂指数的上升，但由于设备使用成本太高，尚未得到广泛应用[5]。

草莓采后腐败与病原菌侵染有着密切的联系[6]。含糖量较高水果的致腐病菌主要有镰刀菌Fusarium、葡萄孢菌Botrytis、链格孢菌Alternaria、青霉菌Penicillum等[7]。化学杀菌剂虽可有效抑制果实采后病害的蔓延，但具有较高的农药残留风险，甚至影响草莓行业公信力[8]。邓义才等[9]报道，以500和1000 mg/L浓度的多菌灵、抑霉唑和咪鲜胺处理采后荔枝2 min，贮藏期间果皮中的杀菌剂会向果肉渗透转移，且可持续至采后35 d。刘萍等[10]报道，经450 g/L咪鲜胺乳油1000倍液和250 g/L吡唑醚菌酯乳油1250倍液处理采后沙糖桔，第3、7和14 d果皮中的残留量均高于最大残留限量国家标准。随着人们对食品安全及环保问题认识的不断提高，化学药剂防腐保鲜越来越受到抵制[11]。

植物精油是芳香植物的高度浓缩提取物，易溶于有机溶剂，具有挥发性，大多具有抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂[12]。作为植物源提取物，植物精油来源广泛、环境友好、食用安全，同时其抑菌谱广、多靶点作用、不易产生抗药性，已成为当前果品保鲜领域的研究热点[13]。左盼盼等[14]报道，猕猴桃采后软腐病主要致病菌为葡萄座腔菌B.dothidea和拟茎点霉菌Phomopsissp.，香芹酚精油对其有较好的抑制活性，EC50值分别为12.15和8.87 μg/L。王靖博等[15]报道，香榧假种皮精油可有效抑制油桃灰霉病菌和根霉病菌菌丝生长，EC50值分别为81.672和209.131 μL/L。本研究从山东省泰安市设施栽培“香野”草莓自然腐烂的果实上分离病原菌，采用传统形态学手段和分子生物学手段进行鉴定，进一步评价肉桂、薄荷、柠檬草、玫瑰草、百里香、丁香和月桂叶7种精油对3种优势病原菌的EC50值，并选取离体抑菌活性较高的几种精油进行草莓果实活体抑菌效果评价，以期为草莓采后病害的科学防控及果实保鲜技术优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试精油

肉桂精油、薄荷精油、柠檬草精油、玫瑰草精油、百里香精油、丁香精油和月桂叶精油，纯度99%，由江西万花香料有限公司提供。

1.2 病果采集

2021年4月20日，在山东省泰安市岱岳区道朗镇（E 116°58′53"，N 36°9′27"）“德莱美”草莓基地，3个设施草莓大棚分别随机采集10枚“香野”草莓近成熟健康果实，带回实验室，室温放置，待自然发病初期进行病原菌分离。

1.3 病原菌分离

采用常规组织分离法，将病健交界组织在75%乙醇溶液中浸泡30 s，以无菌水冲洗3次后，置于PDA平板中央，25 ℃黑暗培养5 d。每枚病果接种3皿，待各菌落形成后，在边缘挑取菌丝接种于新的PDA平板上进行分离、纯化、编号。根据菌落形态，合并相同的病原菌，选取数量最多的3株病原菌进行后续试验。

1.4 病原菌形态鉴定

将纯化后的菌株接种在PDA平板上，25 ℃、黑暗培养5 d，以光学显微镜记录孢子和菌丝形态。

1.5 分子生物学鉴定

挑取菌丝接种于PD液体培养基中，25 ℃、150 r/min摇床培养5 d后，抽滤，以无菌水冲洗3次，取菌丝，以CTAB法提取基因组DNA，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增[16]。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序。所得序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，与同源性较高的已知序列构建系统发育树。

1.6 致病力测定

根据柯赫氏法则[17]，将健康、无伤口的草莓果实表面消毒后，以浓度约为1×106孢子/mL的各病原菌孢子悬浮液浸泡1 min，取出沥干水分，置于无菌保鲜盒中，室温存放，每天观察果实发病情况。

1.7 室内毒力测定

选择直径9 cm的培养皿，在皿盖中央贴1片边长1 cm的正方形滤纸片，灭菌后待用。在超净工作台上，向培养皿内倒入20 mL PDA培养基，剩余空间容积为70 mL，接种直径5 mm的各病原菌菌饼，在滤纸片上分别滴加 1.4、2.8、4.2、5.6 和 7.0 μL各植物精油，迅速封口，使其浓度分别为 20、40、60、80和100 μL/L。以不加精油为对照，每个处理重复4次。25 ℃黑暗培养4～7 d，待对照组菌落直径长至皿内径2/3左右时，采用十字交叉法测量各处理菌落直径。计算各处理的抑制率（%），抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。采用 SPSS18.0软件计算各种精油的EC50值。

1.8 活体抑菌效果测定

选择体外抑菌效果较好的百里香精油、玫瑰草精油、柠檬草精油和肉桂精油进行活体抑菌试验。取10枚健康、无伤口的草莓果实，经表面消毒处理后，在浓度为1×106孢子/mL的各病原菌孢子悬浮液中分别浸泡30 s，取出沥干水分，置于容积1 L的无菌保鲜盒内。盒盖内侧粘贴一张直径5 cm的滤纸，其上滴加100 μL植物精油。以不加精油为对照，每个处理重复3次。常温放置3 d后，记录各处理发生腐烂的病果数，并计算发病率和各处理的防效。发病率（%）＝病果数/总果数×100，防效（%）＝（对照组发病率－处理组发病率）/对照组发病率×100。采用SPSS18.0软件分析各处理间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 草莓采后病原菌的鉴定

2.1.1 形态学鉴定 从自然腐烂的“香野”草莓果实上分离得到病原菌226株，根据形态将相同菌株合并，数量最多的3种病原菌分别有102株、53株和39株，分别编号为CH-1、CH-2和CH-3。

菌株CH-1菌落呈圆形，边缘呈放射状，菌丝较疏松，气生菌丝发达，初为白色，后变为浅褐色，后期可产生黑色菌核。显微镜检显示，CH-1菌丝短，分支多。分生孢子梗较长，丛生，有隔，产生大量分生孢子；分生孢子圆形，无色，单胞，表面光滑（图1）。

图1 菌株CH-1菌落及菌丝显微图片Fig.1 Colony and hypha micrograph of strain CH-1

菌株CH-2菌落呈圆形，颜色由中心向外逐渐由褐色变为白色，菌丝绒状、较密实；显微镜检显示，菌丝细长，分支少，透明，有分隔；分生孢子呈链状，顶端稍弯曲（图2）。

图2 菌株CH-2菌落及显微图片Fig.2 Colony and micrograph of strain CH-2

菌株CH-3菌落呈圆形，颜色为浅灰色至深灰色，有同心圈，菌丝较密，气生菌丝较少；显微镜检显示，菌丝细长，分隔少；分生孢子倒棒锤形，有纵横分隔，分隔处有缢缩（图3）。

图3 菌株CH-3菌落及显微图片Fig.3 Colony and micrograph of strain CH-3

2.1.2 分子生物学鉴定 以真菌通用引物ITS1/ITS4对CH-1、CH-2和CH-3菌株的rDNA-ITS序列进行扩增，分别得到了542、573和555 bp的基因片段。将序列进行BLAST比对发现，3菌株和已知菌株均有较高的相似性。通过构建系统发育树，发现菌株CH-1与灰葡萄孢菌B.cinerea聚在一枝（图4），相似度最高，结合菌落和孢子形态特征，将其鉴定为灰葡萄孢菌；菌株CH-2与链格孢菌A.alternata相似度最高（图5），结合菌落形态特征，将其鉴定为链格孢菌；菌株CH-3与枝孢菌C.tenuissimum聚在一枝（图6），结合菌落形态和文献报道[7]将其鉴定为枝孢菌。

图4 菌株CH-1的ITS系统发育树Fig.4 ITS phylogenetic tree of CH-1

图6 菌株CH-3的ITS系统发育树Fig.6 ITS phylogenetic tree of CH-3

2.1.3 致病力鉴定 3株病原菌的孢子悬浮液处理，2～3 d均可使草莓果实发病，与原发病症状一致。且病原菌重新分离后，培养性状与原菌株一致（图7）。

图7 病原菌回接症状Fig.7 Re-inoculated symptom of pathogens

2.2 7种精油对草莓采后病原菌的抑制活性

2.2.1 7种精油对草莓果实灰葡萄孢菌的抑制活性 在供试7种精油中，丁香精油对草莓果实灰葡萄孢菌的抑制活性最低，EC50值为96.074 μL/L；百里香精油对灰葡萄孢菌的毒力最高，EC50值为39.998 μL/L，相较于丁香精油的相对毒力指数为2.40；其次为玫瑰草精油，EC50值为41.545 μL/L，相对毒力指数为2.31；此外，肉桂精油、薄荷精油和柠檬草精油的EC50值分别为61.684、72.553和79.631 μL/L，相对毒力指数分别为1.56、1.32和1.21（表1）。

表1 7种精油对草莓果实灰葡萄孢菌的室内毒力Table 1 Indoor toxicity of 7 kinds of essential oil on B.cinerea of strawberry fruit

2.2.2 7种精油对草莓果实链格孢菌的抑制活性 在供试7种精油中，月桂叶精油对草莓果实链格孢菌的室内毒力最低，EC50值为64.815 μL/L；百里香精油的室内毒力最高，EC50值为18.456 μL/L，相较于月桂叶精油的相对毒力指数为3.51；其次为柠檬草精油，EC50值为29.448 μL/L，相对毒力指数为2.20；玫瑰草精油的EC50值为40.179 μL/L，相对毒力指数为1.61；肉桂精油、丁香精油和薄荷精油对草莓果实链格孢菌的室内毒力较低，EC50值分别为53.464、54.441和57.507 μL/L，相对毒力指数分别为1.21、1.19和1.13（表2）。

表2 7种精油对草莓果实链格孢菌的室内毒力Table 2 Indoor toxicity of 7 kinds of essential oil on A.alternata of strawberry fruit

2.2.3 7种精油对草莓果实枝孢菌的抑制活性 由表3可以看出，在供试7种精油中，月桂叶精油对草莓果实枝孢菌的抑制活性最低，EC50值为79.322 μL/L；薄荷精油次之，EC50值为78.619 μL/L，相较于月桂叶精油的相对毒力指数为1.01；柠檬草精油对枝孢菌的活性最高，EC50值为30.523 μL/L，相较于月桂叶精油的相对毒力指数为2.60；此外，玫瑰草精油、百里香精油、肉桂精油和丁香精油的EC50值分别为44.370、48.264、53.076和54.670 μL/L，相对毒力指数分别为1.79、1.64、1.49和1.45。

表3 7种精油对草莓果实枝孢菌的室内毒力Table 3 Indoor toxicity of 7 kinds of essential oil on C.tenuissimum of strawberry fruit

2.3 4种精油的活体抑菌效果评价

浓度均为100 μL/L，百里香精油和玫瑰草精油对草莓灰葡萄孢菌的活体抑菌效果较好，防效分别为86.21%和72.41%。百里香精油和柠檬草精油对草莓链格孢菌的防效较高，分别为89.29%和78.57%。4种精油对枝孢菌的活体抑菌效果均略低，其中柠檬草精油防效最高，为75.86%（表4）。

3 讨论

病原菌侵染引起的果实腐烂是造成草莓采后损失的重要原因之一。探明草莓果实贮藏期主要致病菌种类，并探索无毒、环境友好的抑菌手段，对延长草莓货架期和保障草莓产业食品安全具有重要意义[18]。本研究经过形态学和分子生物学鉴定，初步确定山东省泰安市“香野”草莓采后主要病原菌为灰葡萄孢菌、链格孢菌和枝孢菌。这与李英华等[19]报道的新疆“达赛莱克特”草莓果实采后病原菌主要为黑根霉、青霉属、灰葡萄孢属和疫霉属的结果不完全一致，是否存在地区和品种间差异尚有待进一步探明。

Blacharski等[20]报道，异菌脲、啶酰菌胺、咯菌腈等浸泡处理可以降低草莓果实贮藏期间灰霉病等病害的发生率。但随着消费者健康意识的增强，在草莓保鲜领域，化学合成杀菌剂将逐渐被其他更安全有效的处理方式所取代[21]。

很多植物含有天然的抗菌活性成分，是提取生物保鲜剂的重要原料。植物精油一般从植物的花、叶片、果实或根茎中提取，经过提炼浓缩而得，具有抗菌和抗氧化的作用，被美国 FDA认可为“一般认为安全的物质”（Generally Recognized As Safe，GRAS）。其作为广谱性抑菌剂，已逐渐应用于果品保鲜领域[22]。植物精油对微生物的作用方式十分复杂，报道较多的主要包括2种：一种是破坏菌体细胞膜结构，导致细胞膜变形，或胞内物质渗漏，诱发菌体溶解；第二种是抑制孢子萌发和菌丝生长[23]。王丹等[16]报道，肉桂精油对蓝莓采后尖孢镰刀菌、链格孢菌和灰葡萄孢菌均有较好的抑制效果，其最小抑菌浓度分别为60、30和 30 μL/L。翟浩等[13]报道，80 μL/L肉桂精油对免套袋苹果采后葡萄座腔菌B.dothidea、链格孢菌Alternaria、粉红单端孢菌Trichotheciumroseum、韦司梅拟盘多毛孢菌Pestalotiopsisvismiae、胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides及产核枝顶孢菌Acremoniumsclerotigenum的抑制率均超过80%。刘瑞玲等[24]从贮藏期红肉火龙果中分离得到2种病原菌，分别为层生镰刀菌和平头炭疽菌，发现2000 μL/L香芹酚精油、肉桂精油和百里香精油对其菌丝生长抑制率均为 100%。卢锟等[25]报道，肉桂精油和丁香精油对储藏期大米青霉和黑曲霉的抑菌效果最好，将肉桂精油与山苍子精油按3:1（v/v）复配，其对大米青霉和黑曲霉的最小抑菌浓度为0.1 μL/mL。

本研究评价了薄荷精油、丁香精油、柠檬草精油、玫瑰草精油、月桂叶精油、肉桂精油和百里香精油对“香野”草莓果实采后灰葡萄孢菌、链格孢菌和枝孢菌的室内毒力，发现百里香精油对灰葡萄孢菌和链格孢菌的室内毒力均最高，EC50值分别为39.998和18.456 μL/L，柠檬草精油对枝孢菌的活性最高，EC50值为 30.523 μL/L。综合比较可以发现，百里香精油、玫瑰草精油、柠檬草精油及肉桂精油对草莓采后 3种病原菌均具有较高的离体抑制效果。活体抑菌试验结果表明，浓度均为100 μL/L，百里香精油对草莓果实灰葡萄孢菌和链格孢菌的活体抑菌效果较好，防效分别为 86.21%和 89.29%。4种精油对枝孢菌的活体抑菌效果均略低，其中柠檬草精油防效最高，为75.86%。由此可见，百里香精油和柠檬草精油对草莓果实采后病害的活体抑菌效果较好，但其抑菌机制尚有待进一步研究。

将可食性成膜材料与抑菌精油相结合，既可降低果实营养物质的消耗，又能抑制病原菌的增殖，对草莓果品保鲜具有重要意义[26]。吴子龙等[27]报道，壳聚糖与姜精油配置成保鲜液，进行草莓涂膜处理，可以降低草莓腐烂率、失重率，减少Vc和可溶性糖含量的损失，延缓草莓贮藏品质的下降。康明丽等[28]报道，在羧甲基纤维素钠溶液中添加大蒜精油作为涂膜材料处理草莓，可降低果实呼吸作用强度，延缓花色苷的分解，有良好的护色作用。本研究发现，百里香精油、玫瑰草精油、柠檬草精油及肉桂精油对草莓采后3种病原菌均具有较高的抑制效果，在后续研究中，可将上述精油与可食性涂膜材料相结合，制备含功能精油的成膜剂，提高精油稳定性，助力草莓贮藏保鲜领域的绿色高效发展。