南蛇藤素通过调控M2型巨噬细胞极化提高A549细胞对顺铂的敏感性①

于 博 车成日 林星（延边大学医学院，延吉 133002）

肺癌是全球最常见癌症之一，且致死率最高。每年新增确诊患者约180万，死亡人数达160万。尽管肺癌治疗方法不断更新，但由于其高转移性及原发性或获得性耐药，肺癌患者五年生存率仅为15%左右［1-2］。肿瘤微环境是促进肿瘤发生发展的重要因素。肿瘤微环境中众多的浸润炎症细胞中，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）最为丰富，占总数的30%～50%。恶性肿瘤中的TAMs倾向于M2型极化，从而抑制抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤侵袭迁移［3-4］。南蛇藤素（celastrol，CEL）是一种提取于传统中药雷公藤根部的天然五环三萜类化合物，具有抗炎、抗氧化等药理作用［5］。研究表明CEL能够通过多种信号通路抑制胰腺癌和肺癌增殖、黏附、侵袭、迁移等［6-7］。但CEL是否可通过调控TAMs极化影响肺癌化疗敏感性有待进一步研究。本研究旨在探讨CEL通过影响M2型巨噬细胞极化提高人肺癌细胞A549对顺铂敏感性的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料人肺癌细胞株A549、巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院细胞库；CEL购自上海源叶生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购自索莱宝；Easy Pure Viral DNA/RNA Kit购自Transgen Biotech；LY-294002购自贝博生物有限公司；CD163（93498）、p-PI3K（64326）、PI3K（2537）、

p-AKT（5831）、AKT（53270）、Bcl2（15071）、Bax（5023）和GAPDH（5174）抗体购自Cell Signaling Technology；电泳仪及电泳槽购自美国E-C Apparatus Corporation；全波长酶标仪、Western blot转膜仪和Gel Doc凝胶成像仪购自美国Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8增殖实验取对数生长期RAW264.7细胞和A549细胞，以2×104个/孔接种于96孔板，细胞生长至70%左右融合时，加入不同浓度CEL（0、10、20、40、80、100 nmol/L），24 h后10μl/孔加入CCK-8试剂，2 h后测定450 nm处吸光度（OD）。

1.2.2 巨噬细胞M2型极化诱导取对数生长期RAW264.7细胞接种于培养皿，加入IL-4/IL-13（20 ng/ml）处理48 h诱导M2极化，qRT-PCR和细胞免疫荧光实验检测M2型巨噬细胞标志物表达。

1.2.3 qRT-PCR RAW264.7经极化诱导后，给予40 nmol/L CEL处理24 h，收集并纯化所有RNA，合成cDNA，采用Bio-Rad SYBR Premix进行qRT-PCR分析。MRC1、Arg1、Actin的鼠引物序列见表1，以Actin为内参。PCR循环条件：95℃预变性30 s，95℃5 s，60℃30 s，共40个循环。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 Primers for qRT-PCR

1.2.4 细胞免疫荧光实验RAW264.7细胞接种于6孔板，经IL-4/IL-13诱导极化后，给予40 nmol/L CEL处理24 h，4%多聚甲醛固定30 min，3%Triton-X 100孵 育10 min，5%BSA封 闭，加 入CD163抗 体（1∶100）孵育2 h，PBS清洗，加入FITC标记的荧光二抗（1∶500）室温孵育1 h，含DAPI封片液封片，荧光显微镜拍照。

1.2.5 Western blot收集细胞碎片进行裂解，每孔30μg蛋白经10%SDS-PAGE电泳（120 V，90 min），根据分子量分离蛋白，转至PVDF膜（300 mA，60 min），5%脱脂奶粉TBST缓冲液室温封闭2 h，分别加入抗体p-PI3K（1∶2 000）、PI3K（1∶2 000）、p-AKT（1∶2 000）、AKT（1∶2 000）、Bcl-2（1∶3 000）、Bax（1∶2 000）和GAPDH（1∶3 000）室温孵育2 h，TBST清洗3次，加入HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗（1∶8 000）室温孵育2 h，凝胶成像系统拍照。

1.2.6 CEL对A549细胞顺铂敏感性的影响将A549细胞分为对照组、CEL组、M2组（A549细胞与M2型巨噬细胞共培养）、M2+CEL组（A549细胞与CEL处理的M2型巨噬细胞共培养）和M2+LY-294002组（A549细胞与LY-294002处理的M2型巨噬细胞共培养），将不同组A549细胞接种于96孔板，80μmol/L顺铂处理24 h，CCK-8检测细胞活性。

1.3 统计学分析采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析，计量数据以xˉ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CEL对RAW264.7细胞和A549细胞活性的影响当CEL达到80 nmol/L时抑制RAW264.7细胞活性，但对A549细胞活性无影响（图1）。因此，为排除CEL对RAW264.7细胞活性的影响，选择40 nmol/L进行后续实验。

图1 CEL对RAW264.7细胞和A549细胞活性的影响Fig.1 Effect of CEL on cell viabilities of RAW264.7 and A549 cells

2.2 CEL对RAW264.7细胞M2型标志物MRC1和Arg1 mRNA水平的影响与对照组相比，IL-4/13组RAW264.7细胞MRC1和Arg1 mRNA水平 明 显升高，与IL-4/13组相比，CEL组RAW264.7细胞MRC1和Arg1 mRNA水平显著降低（图2）。

图2 CEL对RAW264.7细胞M2型标志物MRC1和Arg1 mRNA水平的影响Fig.2 Effect of CEL on mRNA expressions of M2-type markers MRC1 and Arg1 of RAW264.7 cells

2.3 CEL对RAW264.7细胞M2型标志物CD163蛋白表达的影响免疫荧光检测CD163表达，结果表明，IL-4/13组RAW264.7细胞CD163表达明显高于对照组，而CEL处理后，细胞CD163表达低于IL-4/13组（图3）。

图3 CEL对RAW264.7细胞M2型标 志物CD163蛋白表达的影响Fig.3 Effect of CEL on M2-type marker CD163 protein expression in RAW264.7 cells

2.4 CEL对RAW264.7细 胞PI3K/AKT的 影 响Western blot检测PI3K/AKT蛋白表达，结果显示，IL-4/13组RAW264.7细 胞p-PI3K和p-AKT表 达 明显高于对照组，而加入CEL后p-PI3K和p-AKT表达下降，表明CEL能够抑制M2型巨噬细胞PI3K/AKT信号通路（图4A）。为进一步探讨CEL是否通过PI3K/AKT信号通路抑制M2型极化，M2型巨噬细胞中加入LY-294002阻滞PI3K/AKT信号通路，qRTPCR检 测MRC1和Arg1水 平，结 果 与CEL作 用 类似，LY-294002也能抑制MRC1和Arg1 mRNA表达（图4B）。

图4 CEL对RAW264.7细胞PI3K/AKT的影响Fig.4 Effect of CEL on PI3K/AKT of RAW264.7 cells

2.5 CEL对A549细胞顺铂敏感性的影响IL-4/13组细胞活性明显高于对照组，而加入CEL或LY-294002后，IL-4/13组细胞活性明显降低，表明CEL能够增强A549细胞对顺铂的化疗敏感性（图5）。

图5 CEL对A549细胞顺铂敏感性的影响Fig.5 Effect of CEL on cisplatin sensitivity of A549 cells

2.6 CEL对顺铂诱导的A549细胞凋亡的影响A549细胞与M2型巨噬细胞共培养后，分别加入40 nmol/L CEL和10μmol/L LY-294002，24 h后给予10μmol/L顺铂孵育24 h，收集细胞提取蛋白，Western blot检测细胞Bcl-2和Bax蛋白表达，结果显示，与对照组比较，IL-4/13组细胞Bcl-2表达升高而Bax表达下降，与IL-4/13组相比，CEL和LY-294002处理后Bcl-2表达下降而Bax表达升高（P＜0.01，图6）。表明CEL可促进顺铂诱导的A549细胞凋亡。

图6 CEL对顺铂诱导的A549细胞凋亡的影响Fig.6 Effect of CEL on cisplatin-induced apoptosis in A549 cells

3 讨论

肺癌临床治疗仍以手术治疗和化疗为主要方案，原发性或获得性耐药是肺癌患者治疗失败和复发的主要原因之一。由于标准抗癌疗法疗效较差及副作用严重，天然药物成为新的研究热点。大量研究表明，CEL在体内外均具有较强的抗肿瘤活性。但相关研究通常强调CEL对肿瘤细胞增殖和凋亡的直接影响，关于CEL是否可影响肿瘤微环境中巨噬细胞极化从而影响肺癌细胞化疗敏感性的研究尚未见报道。

肿瘤进展伴随微环境改变。TAMs是肿瘤微环境的重要组成，也是肿瘤进展的主要原因。研究表明，M2型巨噬细胞具有抗炎、抗肿瘤、促进肿瘤免疫逃逸等作用［8］。因此，调节M2型TAMs可能是肿瘤治疗的潜在方法。CEL能够通过阻滞M2型巨噬细胞极化抑制小鼠乳腺癌细胞4T1肺转移。本研究同样发现，40 nmol/L CEL能够明显抑制M2型巨噬细胞标志物mRNA和蛋白表达。

越来越多研究表明多种细胞信号通路参与巨噬细胞表型转化。因此，本研究进一步探索了CEL抑制M2型巨噬细胞极化的潜在机制。ZHAO等［9］表明巨噬细胞清道夫受体1通过激活PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin通路促进M2型极化。此外，ZHU等［10］报道CEL通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制胶质瘤血管模拟形成和血管生成。本研究显示，CEL显著降低M2型巨噬细胞p-PI3K和p-AKT水平，且CEL与LY-294002均能抑制M2型巨噬细胞标志 物MRC1和Arg1 mRNA表达，表明CEL通过PI3K/AKT信号通路抑制巨噬细胞M2型极化。

顺铂是肺癌的主要化疗药物之一，通过诱导DNA损伤和凋亡抑制肿瘤生长，但顺铂耐药已成为高效治疗的主要障碍［11-12］。WEI等［13］研究表明，M2型巨噬细胞能够促进肺癌细胞对5-氟尿嘧啶耐药。因此，基于CEL对M2型巨噬细胞极化的调节作用，课题组进一步研究了CEL对A549顺铂敏感性的作用，结果表明CEL能够抑制M2型巨噬细胞诱导的A549细胞对顺铂的耐药性，且LY-294002与CEL作用相同。

综上所述，CEL通过PI3K/AKT信号通路抑制M2型巨噬细胞极化，从而提高A549细胞对顺铂的敏感性。