黄芩素对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损及TGF-β1/CTGF通路的影响①

马晓惠 王增强 程晓蕾 毛婷婷 陈 宏（天津市人民医院皮肤科，天津 300121）

银屑病是一种常见的以皮肤鳞屑性红斑为特征的慢性炎症性皮肤病，以皮损处微血管异常增生为主要病理表现［1-2］。近十年有关银屑病与血管新生的研究越来越多，相关领域学者一直致力于探究治疗银屑病的新靶点，而中医药治疗血管相关疾病具有丰富经验［3］。黄芩素（Baicalein）是从黄芩根中提取的黄酮类单体化合物，对炎症、肿瘤、纤维化性疾病、心脑血管性疾病及神经性疾病均具有良好防治作用［4-5］。临床上大黄、黄芩用于治疗银屑病有一定疗效，但黄芩素对银屑病的治疗作用尚未见报道。既往研究表明，黄芩素能通过抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达抑制血管生成，推测黄芩素可通过抑制皮损组织血管新生改善银屑病样皮损［6-8］。本研究拟采用咪喹莫特诱导小鼠银屑病模型，观察不同浓度黄芩素对小鼠皮损组织病理学变化及炎症因子表达的影响，探讨其可能作用机制，为银屑病防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物60只8周龄雄性SPF级BALB/c小鼠，体质量（20±2）g，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，许可证号：SCXK（京）2019-0011。饲养条件：22～24℃，50%～65%相对湿度，12 h光/12 h暗循环，自由进食和饮水，适应性饲养1周后进行实验。

1.1.2 试剂与仪器黄芩素（纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司）；IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ ELISA检测试剂盒（武汉爱博泰克生物公司）；HE染色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白裂解液（上海碧云天生物技术公司）；CD31、TGF-β1、VEGF、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、GAPDH抗体（美国Abcam公司）；7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；电泳仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；多功能酶标仪（美国Thermo公司）；RM2016病理切片机（上海莱卡仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组及建模60只BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、地塞米松组（5 mg/kg）、黄芩素低（15 mg/kg）、中（30 mg/kg）、高（60 mg/kg）剂量组，每组10只。脱去所有小鼠背部毛发（2 cm×3 cm），空白对照组小鼠背部涂抹62.5 mg凡士林，同时灌胃给予生理盐水（0.2 ml/只）；其余各组小鼠背部涂抹62.5 mg 5%咪喹莫特乳膏，模型组小鼠灌胃给予生理盐水（0.2 ml/只），地塞米松组小鼠灌胃给予地塞米松溶液（5 mg/kg，0.2 ml/只）；黄芩素低、中、高剂量组小鼠灌胃给予黄芩素溶液（15、30、60 mg/kg，0.2 ml/只），1次/d，共7 d。

1.2.2 银屑病皮损面积及严重程度（PASI）评分涂抹咪喹莫特乳膏第1天开始，每天观察并记录各组小鼠皮损变化，根据PASI评分标准对小鼠皮损处红斑、鳞屑、表皮厚度情况进行评分，0分：无损伤；1分：轻度损伤；2分：中度损伤；3分：重度损伤；4分：极重度损伤，各指标分数总和为最终得分，总分12分，评分越高代表银屑病情况越严重［9］。

1.2.3 HE染色观察小鼠皮肤组织病理学变化取各组小鼠背部部分皮损组织，4%多聚甲醛溶液固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋并切片，按试剂盒说明书进行HE染色，显微镜下观察拍照。

1.2.4 ELISA检测皮肤组织IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ含量取小鼠皮损组织，加入裂解液冰浴超声匀浆，吸取匀浆置于离心管，4℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清保存待用。按照ELISA检测试剂盒说明书操作，吸取等量上清置于96孔板，酶标仪测定各孔光密度（OD450），根据标准液结果绘制标准曲线，计算皮肤组织IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量。

1.2.5 免疫组织化学染色检测皮损组织微血管密度（MVD）取1.2.3制备的皮损组织石蜡切片，按照免疫组化试剂盒说明书进行CD31染色，显微镜下可观察到阳性染色部分为棕黄色，选取血管密度较高区域，高倍镜下选取3个密度较大视野进行微血管计数并取平均值，MVD以每平方毫米的毛细血管数为单位进行计算（个/mm2）。

1.2.6 qRT-PCR检测皮肤组织TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA水平取各组小鼠背部皮损组织冰浴匀浆，加入Trizol混匀，静置孵育20 min充分提取样本RNA，4℃、12 000 r/min离心20 min，移除上清，底部白色沉淀即为RNA，溶解底部RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。反应条件：95℃预变性15 s，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸32 s，40个循环。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7 Western blot检测皮损组织TGF-β1、CTGF和VEGF蛋白表达取小鼠背部皮肤组织，RIPA裂解液裂解组织提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行凝胶电泳分离，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭3 h，加入TGF-β1、CTGF、VEGF和GAPDH一抗稀释液（1∶1 000）4℃孵育过夜，洗涤，添加HRP标记的二抗室温孵育1 h，ECL发光显影，光凝胶成像仪中成像，Image J图像分析软件分析，以目的条带与GAPDH灰度值比值作为目的蛋白相对表达。

1.3 统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩素对小鼠皮损的影响与空白对照组相比，模型组小鼠皮肤在涂抹咪喹莫特乳膏1 d后即出现红斑，第2、3天出现鳞屑，随着时间推移皮损日益严重，红斑由淡粉色小斑点变为大面积暗红色斑块，鳞屑增多成片状，皮肤增厚浸润明显。与模型组同期相比，黄芩素中、高剂量组及地塞米松组小鼠皮损症状明显减轻，鳞屑稀少，浸润增厚不明显，红斑色浅，但黄芩素低剂量组皮损情况变化不明显。与空白对照组相比，模型组小鼠PASI评分显著提高（P＜0.05），与模型组相比，黄芩素中、高剂量组及地塞米松组小鼠PASI评分显著降低（P＜0.05），黄芩素低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 小鼠PASI评分比较（±s，n=10）Tab.2 Comparison of PASI scores in mice（±s，n=10）

表2 小鼠PASI评分比较（±s，n=10）Tab.2 Comparison of PASI scores in mice（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

Groups Control Model Dex Baicalein low-dose Baicalein medium-dose Baicalein high-dose 1 d 0 0 0 0 0 0 2 d 0.22±0.01 1.15±0.041）0.76±0.032）1.09±0.06 0.94±0.062）0.85±0.072）3 d 0.20±0.05 2.56±0.331）1.37±0.092）2.42±0.14 2.07±0.102）1.69±0.112）4 d 0.26±0.05 4.14±0.141）2.05±0.112）4.01±0.17 3.38±0.122）2.89±0.162）5 d 0.23±0.04 6.48±0.181）2.99±0.172）6.32±0.10 5.61±0.152）4.26±0.142）6 d 0.20±0.06 8.48±0.111）4.47±0.142）8.32±0.09 7.40±0.212）6.04±0.202）7 d 0.19±0.07 9.79±0.221）5.85±0.172）9.56±0.26 8.46±0.192）7.70±0.212）

2.2 黄芩素对小鼠皮肤组织病理学变化的影响空白对照组小鼠皮肤表皮层薄且排列规则；模型组和黄芩素低剂量组小鼠表皮增生明显，角质层存在大量未完全角化角质细胞；黄芩素中、高剂量组及地塞米松组小鼠皮肤表皮层较模型组薄，角化不全细胞明显减少（图1）。

图1 各组小鼠皮肤组织病理学观察（HE染色，×200）Fig.1 Skin histopathological observation of mice in each group（HE staining，×200）

2.3 黄芩素对小鼠皮肤组织IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量的影响与空白对照组相比，模型组小鼠皮肤组织IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量显著上升（P＜0.05）；与模型组相比，黄芩素中、高剂量组及地塞米松组IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量显著下降（P＜0.05），黄芩素低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

表3 小鼠皮肤组织IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量比较（±s，n=10，pg/ml）Tab.3 Comparison of contents of IL-17，IL-23，TNF-αand IFN-γin skin tissues（±s，n=10，pg/ml）

表3 小鼠皮肤组织IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量比较（±s，n=10，pg/ml）Tab.3 Comparison of contents of IL-17，IL-23，TNF-αand IFN-γin skin tissues（±s，n=10，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

Groups Control Model Dex Baicalein low-dose Baicalein medium-dose Baicalein high-dose IL-17 151.59±15.49 470.16±17.031）236.01±15.532）431.58±20.48 372.60±28.562）288.13±19.472）IL-23 38.53±5.78 99.47±8.541）54.78±6.252）97.51±8.11 84.32±9.452）63.38±6.472）TNF-α 96.59±9.17 404.03±26.921）170.22±18.312）393.08±28.57 273.90±14.712）198.78±13.382）IFN-γ 112.81±11.33 386.63±13.661）185.90±10.852）375.33±25.73 290.25±10.532）247.97±14.982）

2.4 黄芩素对小鼠皮肤组织CD31表达及MVD值的影响CD31在血管内皮细胞胞浆中表达，染色后呈棕黄色（图2）。与空白对照组（4.12±0.71）相比，模型组小鼠皮肤组织MVD值（15.49±2.32）显著提高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩素中（10.78±1.32）、高（7.04±1.21）剂量组及地塞米松组（5.97±1.06）皮肤组织MVD值显著降低（P＜0.05），黄芩素低剂量组（14.78±1.62）差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组小鼠皮肤组织CD31免疫组织化学染色（×400）Fig.2 CD31 immunohistochemical staining of skin tissue in each group（×400）

2.5 黄芩素对小鼠皮肤组织TGF-β1、CTGF和VEGF表达的影响与空白对照组相比，模型组小鼠皮肤组织TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表达显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，黄芩素中、高剂量组及地塞米松组皮肤组织TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表达显著减少（P＜0.05），黄芩素低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05，表4、图3）。

图3 Western blot检测皮肤组织TGF-β1、CTGF和VEGF蛋白表达Fig.3 Protein expressions of TGF-β1，CTGF and VEGF in skin tissues detected by Western blot

表4 小鼠皮肤组织中TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表达比较（±s，n=10）Tab.4 Comparison of mRNA and protein expressions of TGF-β1，CTGF and VEGF in skin tissue（±s，n=10）

表4 小鼠皮肤组织中TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表达比较（±s，n=10）Tab.4 Comparison of mRNA and protein expressions of TGF-β1，CTGF and VEGF in skin tissue（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

Groups Control Model Dex Baicalein low-dose Baicalein medium-dose Baicalein high-dose TGF-β1 mRNA 1.02±0.09 3.97±0.241）1.57±0.122）3.87±0.21 2.83±0.152）2.38±0.122）Protein 0.14±0.03 1.18±0.051）0.23±0.032）1.17±0.07 0.88±0.042）0.57±0.052）CTGF mRNA 1.02±0.07 4.00±0.221）1.61±0.072）3.93±0.16 2.99±0.112）2.38±0.102）Protein 0.07±0.03 1.07±0.081）0.18±0.042）1.07±0.08 0.80±0.072）0.31±0.042）VEGF mRNA 1.00±0.03 3.00±0.141）1.44±0.072）2.91±0.10 2.42±0.092）2.15±0.102）Protein 0.09±0.03 1.06±0.081）0.17±0.032）1.08±0.06 0.76±0.062）0.45±0.052）

3 讨论

银屑病临床治疗多采用免疫抑制剂、激素类、维生素A酸类等药物，虽有疗效但易复发，且副作用大，寻求经济、副作用小的药物对临床治疗银屑病具有重要意义。随着中医药在银屑病血管新生方面研究进展，近年研究发现，中医药治疗银屑病具有显著临床疗效［10］。本研究通过向BALB/c小鼠背部涂抹咪喹莫特建立银屑病动物模型，采用PASI评分和HE病理染色评估各组小鼠背部皮肤病理变化，结果发现，模型组小鼠背部皮肤出现红斑、表皮肥厚、鳞屑成层等现象，病理切片显示表皮层增生明显，角质层角化不全，与既往研究一致，提示建模成功［11］。给予中剂量和高剂量黄芩素治疗后，小鼠银屑病症状明显改善，银屑病样皮损减轻，PASI评分降低，角化不全现象改善，表皮厚度明显薄于模型组，其中高剂量黄芩素改善效果接近地塞米松组，提示黄芩素能改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损。

现有研究认为，银屑病是一种免疫介导的炎症性皮肤病，IL-23/IL-17炎症轴在银屑病发生发展过程中发挥重要作用［12-13］。本研究通过ELISA检测皮损组织IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量，结果显示模型组炎症因子水平均显著上调，与HAU等［14］研究结果相符，而黄芩素治疗能明显降低皮损处炎症因子表达，与病理结果炎症浸润减轻一致，提示黄芩素可能通过降低银屑病小鼠皮损组织炎症因子水平发挥治疗作用。

银屑病发生发展和复发与微血管生成异常关系密切，而血管形成通过多种血管生成诱导因子和抑制因子平衡进行调节。VEGF可通过调节血管通透性使血管内皮细胞发生增生、迁移，促使新生血管形成［15］；CTGF主要通过促进内皮细胞增殖和迁移介导内皮细胞黏附，促进内皮细胞存活，诱导内皮细胞形成管状而促进新生血管形成；TGF-β1也是创面愈合过程中一种重要的作用因子，参与成纤维细胞增生、血管再生、细胞外基质合成与重塑等过程，而CTGF作为TGF-β1表达通路下游调节因子，在血管再生过程中和TGF-β1具有协同作用［16］。CD31主要存在于内皮细胞表面，可反映血管增殖变化及组织形态变化，而MVD代表单位面积内微血管数，能反映组织血管生成活性［17］。本研究通过CD31免疫组织化学染色检测并计算皮损处MVD，同时检测皮损组织TGF-β1、CTGF和VEGF表达以评估新生血管情况，结果显示，模型组小鼠皮损MVD值及TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA和蛋白表达显著上升，而中剂量和高剂量黄芩素干预组相关指标均明显下调，说明黄芩素能通过抑制皮损组织血管新生改善银屑病样皮损。

综上所述，黄芩素可通过阻断TGF-β1/CTGF信号通路减轻炎症反应，抑制皮损组织血管新生，从而延缓咪喹莫特诱导的小鼠银屑病进展，且黄芩素对银屑病皮损的改善效果呈剂量依赖性。本研究可为黄芩素治疗银屑病提供依据，并为其作用靶点及相关通路深入研究奠定了基础。