干细胞治疗肝硬化的研究进展

郭春柳，黄晓曦

（中南大学湘雅医学院附属海口医院消化内科，海南 海口 570208）

肝硬化是由各种慢性肝损伤导致的终末阶段，以假小叶形成、肝组织弥漫性纤维化和肝内外血管增殖为病理特征。全世界每年约有100 万人死于肝硬化并发症，是全球第11 大最常见的死亡原因，严重威胁人类健康［1］。对于失代偿期肝硬化，内科治疗效果欠佳，原位肝移植（orthotopic liver transplantation，OLT）被认为是唯一有效的治疗手段，但由于医疗费用高昂、供肝来源短缺、术后并发症多、终身免疫排斥等因素，极大地限制了OLT 在临床中的广泛应用。因此，迫切需要寻找一种可以广泛应用且安全有效的替代方案。干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞，作为再生医学的“种子”细胞，目前已经在神经［2］、血液［3］、心血管［4］、骨关节［5］等多个系统疾病中做了有益尝试。干细胞在特定条件下可诱导分化为肝细胞，为肝硬化的治疗提供了新的选择，根据来源不同可分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞。

1 肝源性肝干细胞

肝源性肝干细胞又称为内源性肝干细胞，主要包括小肝细胞（small hepatocyte-like progenitor cell，SHPC）、肝卵圆细胞（hepatic oval cell，HOC）、肝细胞（hepatocyte cell，HC）等，其 中 研 究 较 多 的 是HOC。

1.1 肝卵圆细胞（HOC）

HOC 又称为肝祖细胞（hepatic progenitor cells，HPCs），是一种具有双向分化潜能的干细胞，可在一定条件下诱导分化为肝细胞和胆管上皮细胞，因此，有可能成为肝细胞的再生来源。

研究表明，HPCs 对肝细胞再生有积极贡献。Lu 等［6］通过定向删除Mdm2 诱导肝细胞凋亡，然后将HPCs 移植到小鼠肝脏中，发现移植的HPCs 可通过分化为肝细胞和胆管细胞，从而使受损肝脏结构和功能得到明显改善。最近一项研究显示，当Lgr5+肝祖细胞的缺失时可增加CCl4诱导的肝纤维化，而当肝细胞损伤或HGF 和Rspo1 联合诱导产生更多的Lgr5+肝祖细胞时，可促进肝功能障碍的恢复和减轻肝纤维化［7］。

HPCs 在肝脏中含量很低，且分离困难，近年来在体外分化HPCs 引起了人们的兴趣。Katsuda等［8］利用Y-27632，a-83-01 和CHIR99021 的小分子混合物，在体外将大鼠的成熟肝细胞转化为增殖性双能细胞，称为化学诱导肝祖细胞（CLiPs）。为了进一步证实该技术在人肝细胞中的可行性，Kim等［9］从健康和病变的供肝中分离出人肝细胞，在EGF 和 HGF 的 作 用 下，利 用 A83-01 和CHIR99021（AC）两种小分子联合处理，成功将人肝细胞重编程为肝祖细胞，称为人化学源肝祖细胞（hCdHs）。两个研究均表明化学来源的HPCs 可在体内外分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞，有效替换慢性损伤肝组织，并且可以稳定培养。

HPCs 移植治疗肝硬化的有效性在动物实验中得到了初步证实。Awan 等［10］通过预处理将骨髓间充质干细胞分化为HPCs，并将其植入肝纤维化小鼠中，观察到HPCs 可通过减少细胞凋亡和乳酸脱氢酶的释放来改善肝功能。赵丽等［11］发现HPCs 移植可降低2.0%CCL4诱导的小鼠模型中ALT 和AST 活性及肝脏指数，提高生存率。但是移植后是否会出现副作用以及形成肿瘤目前仍不明确，有待进一步研究。

2 非肝源性肝干细胞

非肝源性肝干细胞又称为外源性肝干细胞，主要包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、内皮祖细胞（endothelial progenier cells，EPCs）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等。

2.1 胚胎干细胞（ESCs）

ESCs 是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有无限增殖和分化形成各种组织细胞的潜力，在细胞替代治疗方面具有广阔的应用前景。

利用ESCs 治疗肝病也有相关研究，Tolosa等［12］将欧洲人类胚胎干细胞系（VAL9）移植到对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭小鼠体内，发现可以有效填充肝组织、恢复肝功能。最近的一项研究［13］利用纳米材料建立了一个生长因子持续释放系统，能够持续促进小鼠胚胎干细胞（mESCs）向肝细胞样细胞（hepatocyte-like cells，HLCs）分化，并在体外培养中产生更多的功能性肝细胞，当该系统处理的mESCs 移植到肝损伤小鼠后，可在体内分化为HLCs，并对肝损伤有明显的修复作用。

虽然ESCs 具有治疗肝硬化的分子基础，但由于免疫排斥、医学伦理、致瘤性等因素的限制，目前尚未被批准用于临床治疗。

2.2 内皮祖细胞（EPCs）

EPCs 是未成熟的内皮细胞，属于多能干细胞，主要存在于骨髓、脐血和外周血中。可通过分化为成熟的内皮细胞、释放大量的营养因子和细胞保护因子，以及旁分泌效应，促进新血管生成和组织修复［14，15］。因此可能有益于肝硬化的治疗。

基于EPCs 移植治疗肝硬化在动物实验中得到了广 泛研究，Sakamoto 等［16］将骨髓源性EPCs 经尾静脉注射至大鼠肝硬化模型内，每周1 次，连续4周，发现EPCs 移植可增加肝血流量，减轻肝纤维化及门静脉压力。另有研究显示骨髓源性肝干细胞（BDHSCs）和骨髓源性内皮祖细胞（BM-EPCs）联合移植可显著改善肝功能和肝纤维化，治疗效果明显优于单一类型细胞移植，是一种很有前途的治疗方法［17］。然而最近一项研究却得出了相反的结论，该实验将肝硬化EPCs 移植至胆管结扎法制备的肝硬化大鼠体内，结果显示肝硬化EPCs 移植可促进肝窦内皮细胞（LSEC）分化和肝星状细胞（HSC）激活，从而增加肝脏血管生成和肝纤维化，进一步加重门静脉高压。造成这种结果的差异可能与肝硬化模型制备方法、EPCs 的来源不同有关。

为了进一步评估EPCs 在临床应用中的可行性，D'avola 等［18］将EPCs 经肝动脉注射到11 例失代偿期肝硬化患者体内，随访12 个月，结果显示终末期肝病评分模型显著改善（P＝0.042），并且在90 d存活的9 例患者中，有5 例显示肝静脉气压梯度（HVPG）降低，随访期间无严重不良事件发生。目前正在进行一项3 期随机对照试验（clinicaltrials.gov 标识符：NCT03109236），该试验可能提供关于基于EPCs 的治疗终末期肝硬化患者的潜在临床益处的确切数据。

2.3 间充质干细胞（MSCs）

MSCs 是一类来源于发育早期中胚层、具有自我复制和多向分化潜能的非造血干细胞，最常由骨髓中提取，也可以从脂肪组织、脐带组织、肝脏、牙髓等多种组织中获得。研究发现MSCs 能定向分化为HLCs，并对肝细胞发挥免疫调节、抗炎、抗纤维化、抗氧化应激和抗凋亡等作用［19］，是细胞替代法治疗肝硬化最具有应用价值的成体干细胞。

大量动物实验和临床研究显示，MSCs 移植替代治疗肝硬化具有显著优势，郑雪等［20］将骨髓间充质干细胞（BMSCs）经尾静脉注射至肝纤维化大鼠体内，观察发现，移植组大鼠肝纤维间隔变窄、数量减少，肝小叶结构恢复，肝脏内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达、ALT 和AST 水平低于对照组，且Alb 较之升高（P＜0.05），说明BMSCs 移植能有效改善肝纤维化和促进肝功能恢复。Fang 等［21］将人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）经静脉输入至50 名乙肝肝硬化失代偿期患者体内，结果显示移植组终末期肝病模型和Child-Pugh 评分的改善明显优于对照组，随访期间死亡率低于对照组。李静等［22］对2017 年11 月前发表的MSC 移植治疗肝硬化的RCT 进行荟萃分析，共纳入研究了394 例肝硬化患者，最后得出结论，MSCs 移植治疗可显著改善失代偿期肝硬化患者的肝功能，降低病死率。

MSCs 可通过多种不同的途径移植，而目前关于MSCs 移植治疗肝纤维化的最佳途径仍存在争议。Idriss 等［23］认为与脾内移植相比，经静脉移植BMSCs 治 疗 更 能 降 低IL-1β、IL-6 及INF-γ 等 基 因的表达，从而更有效的抑制炎症反应。Zheng 等［24］研究结果表明，通过尾静脉和肝内注射移植hUCMSCs 治疗效果相当。根据目前的研究，尚无统一的结论，仍需要进一步研究。

MSCs 来源广泛，BMSC 是目前研究最广泛的间充质干细胞，但存在对供体的潜在损伤以及可用数量少等问题，因此，寻找新的MSCs 来源成为近年来的研究热点。

2.3.1 胎盘 Yu 等［25］通过尾静脉将hPMSCs 移植至肝纤维化大鼠中，发现hPMSC 移植可通过降低TGF-β1 和α-SMA 表达，抑制肝星状细胞的活化，从而修复肝纤维化，改善肝功能。

2.3.2 乳牙 Yamaza 等［26］将人乳牙干脱落干细胞（SHED）经脾脏移植到CCL4 诱导的肝纤维化小鼠体内，发现移植的SHED 可分化为肝细胞，并显著降低致纤维化物质和炎症因子的水平，增强抗炎因子的表达，从而表现出抗纤维化和抗炎的作用。

2.3.3 月经血 人的月经血也是肝细胞的潜在来源，称为月经血来源干细胞（MenSCs）。与BMSCs相比，MenSCs 具有无创性收集过程、高增殖率、多能性和低免疫原性等优点［27］，Chen 等［28］首次报道了MenSCs 移植治疗小鼠肝纤维化的效果，结果表明，MenSCs 可以显著改善肝功能，减少胶原蛋白沉积，并通过分泌单核细胞趋化蛋白-1、白介素-6、肝细胞生长因子和骨保护素等旁分泌细胞因子抑制LX-2细胞（肝星状细胞）的增殖。

关于MSCs 移植治疗的安全性一直是人们密切关注的问题，有研究表明，MSCs 移植后有可能分化成不需要的组织，包括骨和软骨［29］，此外，还可能通过抑制抗肿瘤免疫应答和促进新生血管生成而促进肿瘤生长和转移［30］。因此，仍需要对MSCs 治疗的动物模型进行持续监测和长期随访，以确定其致癌作用和其他不利影响。

2.4 造血干细胞（HSCs）

HSCs 位于骨髓中，是血液系统中的成体干细胞，具有分化为血液和免疫系统所有细胞的能力［31］。骨髓中的HSCs 可在组织损伤或人工启动后动员，离开骨髓并进入血液，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是研究和使用最广泛的动员剂。与其他类型干细胞相比，HSCs 具有易于获得、成本低、可来源于自体而无需使用免疫抑制剂等优点。

近年来，基于HSCs 移植治疗肝硬化的研究取得了显著成果。King 等［32］将纯化的HSCs 反复输注于肝纤维化损伤的小鼠体内，发现与对照组相比，HSCs 移植治疗的小鼠肝脏瘢痕形成减少49.7%，并提示HSCs 通过促进巨噬细胞和中性粒细胞募集来介导其抗纤维化作用，联合应用1-磷酸鞘氨醇受体激动剂（FTY720）可增强这种作用。Guo 等［33］回顾性分析了282 例肝硬化患者接受自体HSCs 移植治疗的远期临床疗效，发现实验组的存活时间明显高于对照组，移植后1、2、3、5 年肝功能均有明显改善。且两组的肝癌总发生率无显著性差异（21.1%vs20.4%）。另外有多项临床研究也表明，HSCs 移植能有效地改善晚期肝硬化患者的肝功能、肝组织形态学以及提高患者的生命质量［34-38］。然而近期英国一项多中心、随机对照试验结果却显示，G-CSF或G-CSF 加HSCs 输注并不能改善肝功能障碍或纤维化，此外还可能会增加患者发生不良事件的风险［42］。

整体而言，干细胞治疗肝硬化是安全的，而导致治疗效果不一致可能是由于研究人群、干细胞类型的差异所致。因此，HSCs 移植治疗肝硬化患者的效果、远期安全性等仍有待进一步探讨及验证。

2.5 诱导多能干细胞（iPSCs）

iPSCs 由研究者于2006 年首次发现［39］，是一种通过特定的介质将成体细胞诱导并重新编程为未分化状态的多能干细胞，具有与ESCs 相同的增殖和分化潜能，并同时避免了伦理问题［40］，是最有潜力的干细胞。

iPSCs 可在体外诱导分化为HLCs，是肝细胞的 潜 在 来 源，Takayama 等［41］将1 106 个 人 类iPS-HLCs 经脾内移植到急性和慢性肝衰竭模型小鼠体内，观察发现，移植小鼠的存活率和血清白蛋白水平显著提高，并且提示人iPS-HLCs 的治疗作用主要由肝细胞生长因子（HGF）的分泌来实现的。另外一项研究结果显示人iPS-HLC 薄片移植可通过激活HGF/c-Met 信号，使肝细胞免于细胞死亡，从而改善肝损伤，并且对比发现人iPS-HLC 薄片移植的移植效率明显高于脾内移植［42］。

尽管iPSCs 避免了伦理问题和免疫排斥反应，并在动物试验中取得了一定成果，但仍面临畸胎瘤形成的风险，限制了其在临床中的应用。

3 问题与展望

随着近年来再生医学的进展，基于干细胞移植治疗肝硬化展现了良好的应用前景，并在基础和临床研究中取得了一定成果。但是在大规模应用于临床之前，仍有许多问题需要解决，比如干细胞移植治疗肝硬化的具体机制尚未完全明确；能用于临床治疗的干细胞种类仍偏少；临床试验中细胞制备、剂量、途径、随访、疗效等仍不统一；缺乏多中心、大样本的随机对照研究数据，证据等级有待提高。随着技术和理论的逐步成熟，干细胞移植治疗肝硬化将会更加安全、有效、便捷的展开。