Box-Behnken 响应面法优化满山红油脂质体的处方研究

王庆伟，白丹妮，沈梦婷，王丽红，苏 瑾

（佳木斯大学药学院黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室，黑龙江 佳木斯 154007）

满山红源自杜鹃花科，为杜鹃属植物的干燥叶，其味辛、苦、性寒，具有止咳祛痰的功效［1，2］。现代研究表明满山红不仅可以治疗支气管炎，还具有镇痛、抗癌、抗氧化和强心等药理作用［3］。满山红油是满山红叶经水蒸气蒸馏法提取得到的挥发油，其主要成分有吉马酮、薄荷醇、槲皮素、杜松脑等［4］，有强烈刺激性香气，味清凉而辛。口服给药作为临床上最常见的给药方式，具有安全、方便以及患者依从性好等优点，但满山红油溶解性差导致口服生物利用度大大降低，此外满山红油的气味刺鼻也不利于口服，因此大多数研究将满山红油以制剂的形式应用于临床研究。满山红油的现代制剂有片剂（如消咳喘片）、胶囊剂（复方满山红胶囊），亦有滴丸剂，这些常规的制剂方法对于胃肠道副作用明显，并且容易造成挥发油部分成分的挥发。

脂质体（liposome）是由脂质双分子层（由磷脂和胆固醇组成）构成的封闭囊泡，具有一定的缓释性和靶向性，此外还具有降低药物毒性提高药物稳定性等优势［5］，脂质体可分为传统型、柔性、阳离子型、隐形型、免疫型、磁性、温度敏感型和靶向型等［6］，靶向脂质体是利用脂质体作为药物载体，可使药物直接到达病变组织或靶细胞［7］。Box-Behnken响应面法是一种适用于多因素考察的设计方法，其特点是运用非线性拟合模型来提高准确度，试验次数少，效率高［8-10］。脂质体将满山红油包载之后可以提高满山红油的稳定性，也可以提高其利用率，因此本实验采用乙醇注入法制备满山红油脂质体，Box-Behnken 响 应 面 法［11］优 化 满 山 红 油 脂 质 体 处方，以包封率作为指标，考察满山红油脂质体处方中的卵磷脂与胆固醇的比例、脂药比、磷脂浓度，筛选出满山红油脂质体的最优处方，为设计、制备满山红油新制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

UV-765 紫外-可见分光光度计（上海精密科学仪器厂）；Agilent1100series 高效液相色谱仪（美国安捷伦有限公司）；FA2004N 电子分析天平（上海恒平仪器厂）；Scientz-ⅡD 超声波细胞粉碎机（宁波新芝科技股份有限公司）；DF-101S 集热式恒温磁力搅拌器（河南省予华仪器厂）；Malvern Zetasizer Nano ZSE 纳米粒度电位仪（英国马尔文公司）

1.2 药品

吉马酮（中国食品药品检定研究院，批号：111665-201605）；满山红油（江西恒诚天然香料油有限公司，批号20180101）；注射用卵磷脂（上海太伟药业股份有限公司）；胆固醇（大连美仑生物技术公司）；无水乙醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）

1.3 满山红油脂质体的制备

取10 mL PBS（pH7.4）置50 mL 小烧杯中，放入磁力搅拌器，加热保温至50 ℃，量取5 mL 无水乙醇，将称取的磷脂和胆固醇溶解于无水乙醇中，用注射器从该溶液中吸取5 mL，将一定量的满山红油加入剩余的溶液中，并用另一个注射器吸取剩余溶液，将两份脂质溶液以600 r/min 的速度同时缓慢注入到已配置好的PBS 中，滴加完毕后，继续搅拌，使乙醇挥发完全，冰水浴探头超声，即得［12］。

1.4 含量测定方法

1.4.1 色 谱 条 件 色 谱 柱：C18柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（75∶25，V∶V）；柱温：35 ℃；检测波长：215 nm；流速：1 mL/min；进 样 量：10 μ L［13］。

1.4.2 专属性试验 取不含吉马酮的脂质体、吉马酮标准品、空白脂质体加吉马酮标准品和满山红油放入烧杯中并加入适量甲醇，之后转移到10 mL 容量瓶并定容，根据上述的色谱条件对样品进行测定。

1.4.3 标准曲线的绘制 精密称取吉马酮标准品5.05 mg，将吉马酮标准品放入50 mL 容量瓶，再用甲醇定容，将此浓度的溶液分别稀释成浓度为1.01、5.05、10.10、15.15、20.20、25.25、30.30 μg/mL 的不同溶液，以215 nm 为吸收波长，对上述溶液进行含量测定得出峰面积，以浓度（C）为横坐标，峰面积（S）为纵坐标构建线性方程。

1.4.4 精密度试验 将配制的吉马酮标准品溶液进行稀释，分别稀释成5.05、15.15、25.25 μg/mL 的低、中、高浓度的吉马酮标准品溶液，按照上述的实验条件分别测定5 次，计算日内精密度。再按同样的方法，将3 份标准品溶液分别测定5 d，用于日间精密度计算。

1.4.5 回收率试验 将配制的吉马酮标准品溶液稀释成浓度为101.0 μg/mL 的溶液，从中取0.5、1.5、2.5 mL 各3 份于10 mL 容量瓶中，分别加入不含吉马酮的脂质体溶液2 mL，加入适量甲醇定容，摇晃使其充分溶解，分别得到浓度为5.05、15.15、25.25 μg/mL的吉马酮溶液，每个样品平行测定5 次，通过峰面积计算回收率。

1.5 包封率测定

采用超滤离心法测定。从已制备好的满山红油脂质体中吸取0.5 mL 于超滤离心管中，在转速为10 000 r/min 的条件下离心15 min，取出的滤液加入适量甲醇并放入10 mL 容量瓶，定容至刻度线，取10 μL 进样，测得W游离，另取0.5 mL 满山红油脂质体于10 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，取10 μL 进样，测得W总，包封率（EE）∶EE%＝（W总-W游离）/W总×100%

1.6 单因素试验

1.6.1 卵磷脂与胆固醇比例的考察 按“1.3”项下制备方法，固定卵磷脂的浓度为10 mg/mL，脂药比为10∶1，温度设置为50 ℃，冰浴探头超声10 min，按照磷脂与胆固醇质量比为1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1 分别对满山红油脂质体包封率大小的影响进行考察。

1.6.2 卵磷脂与药物比例的考察 按“1.3”项下制备方法，固定卵磷脂的浓度为10 mg/mL，卵磷脂与胆固醇的比例为7∶1，温度设置为50 ℃，冰浴探头后超声10 min，按照卵磷脂与药物质量比为4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1 分别对满山红油脂质体包封率大小的影响进行考察。

1.6.3 磷脂浓度的考察 按“1.3”项下制备方法，固定卵磷脂与胆固醇的比例为7∶1，脂药比为10∶1 温度设置为50 ℃，冰浴探头后超声10 min，改变卵磷脂浓度分别为3、6、9、12、15 mg/mL，分别对满山红油脂质体包封率大小的影响进行考察。

1.6.4 制备温度考察 按“1.3”项下制备方法，将卵磷脂与胆固醇的质量比固定为7∶1，卵磷脂的浓度为10 mg/mL，脂药比为10∶1，冰浴探头后超声10 min，改变制备温度分别为30、40、50、60、70 ℃，分别对满山红油脂质体包封率大小的影响进行考察。

1.6.5 超声时间的考察 按“1.3”项下制备方法，将卵磷脂与胆固醇的质量比固定为7∶1，卵磷脂的浓度为10 mg/mL，脂药比为10∶1，温度设置为50 ℃，将超声时间设置为5、10、15、20、25 min，分别对满山红油脂质体包封率大小的影响进行考察。

1.7 Box-Behnken 响应面法优化处方

在单因素试验并结合文献的基础上得出3 个对满山红油脂质体包封率影响较显著的因素：卵磷脂与胆固醇的比例（X1）、脂药比（X2）、磷脂浓度（X3），以包封率（Y）作为响应值，采用Box-Behnken 法优化满山红油脂质体处方。试验中每个因素的3 个水平分别记为-1、0、+1。以包封率为考察指标，并且考察值越大越好，采用Design Expert 软件优化满山红油脂质体的处方。见表1。

表1 Box-Behnken 因素水平表Tab 1 Box-Behnken factor level table

2 结果

2.1 含量测定

2.1.1 专属性 在上述色谱条件下，测得空白脂质体（图1）、吉马酮标准品（图2）、空白脂质体加吉马酮标准品（图3）、满山红油脂质体（图4）的液相色谱图。结果显示，辅料对样品的测定无干扰。

图1 空白脂质体液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of blank liposome

图2 吉马酮液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of germacrone

图3 空白脂质体加吉马酮液相色谱图Fig 3 HPLC chromatograms of blank Rhododendri Daurici oil liposome

图4 满山红油脂质体高效液相色谱图Fig 4 HPLC chromatograms of Folium Rhododendri Daurici oil liposome iposome and germacrone

2.1.2 标准曲线的绘制 吉马酮在1～100 mg/mL线性关系良好，得到回归方程为：S＝35.756C-5.9414（r＝0.999 6）。

2.1.3 精密度试验 吉马酮标准品溶液的日内精密度RSD 分别为2.47%、1.84%、1.44%，日间精密度RSD 分别为2.63%、1.63%、1.25%，得出的RSD值均符合要求，表明该方法精密度良好。

2.1.4 回收率试验 3 种吉马酮标准品溶液的平均回收率分别为97.82%、101.19%、98.97%，同时RSD 值也符合方法学要求。

2.2 单因素试验

2.2.1 卵磷脂与胆固醇比例的考察 随着卵磷脂比例的增大，包封率先增大随后平稳，包封率最高为卵磷脂与胆固醇的比例为7∶1，这是因为当卵磷脂用量过低时不足以包封满山红油，当卵磷脂用量过高时，体系呈乳白色，部分磷脂从脂质体表明析出［14］，因此选择5∶1～9∶1 作为卵磷脂与胆固醇的比例。

2.2.2 卵磷脂与药物比例的考察 包封率先增大后减小，在比例达到10∶1 时包封率最大，之后当药物浓度过低时包封率又随之减小［14］，因此选择脂药比为8∶1～12∶1 做进一步研究。

2.2.3 磷脂浓度的考察 随着磷脂浓度的增加，包封率先增大，后减小，考虑到载药量，磷脂浓度选择9～15 mg/mL 进一步考察。

2.2.4 制备温度考察 随着温度的增加，包封率呈现先减小后增大的趋势，温度过低不利于形成脂质体，但温度过高也会使得卵磷脂发生氧化，因此温度选择在40～60 ℃，并且温度在该范围内无明显变化。

2.2.5 超声时间的考察 随着超声时间的增加，包封率呈现先增大后减小的趋势，10～20 min 区间包封率最高，最终选择15 min 作为实验的超声时间。

2.3 Box-Behnken 响应面法优化处方

根据Design-Expert 8.0.6软件所得出的数据研究因素对包封率的影响。预测模型的P值小于0.000 1，证明模型极其显著。失拟项P值为0.326 4，大于0.05，模型信号噪声比为26.218，大于4，模型分辨力强。拟合得二次回归方程：Y1＝80.03+2.49A+2.93B-7.55C+0.070AB+0.67AC+0.27BC-7.07A2-2.01B2-4.09C2。其相关系数r2＝0.987 2，失拟项不显著，证明回归方程与实测值拟合较好，该方程可以代替分析。因素A、B、C 的P值均小于0.000 1，说明卵磷脂与胆固醇的比例、脂药比、磷脂浓度对包封率的影响都有显著差异［15］。见表2、3。

表2 BBD 设计与结果Tab 2 BBD design and results

图5 中的响应面图显示不同的独立变量对满山红油脂质体处方包封率的影响，由图可知，随着胆固醇与卵磷脂比例（X1）的增大，包封率先增大后减小；随着脂药比（X2）的增大，包封率逐渐减小；随着磷脂浓度（X3）增大，包封率先增大后减小。

图5 包封率响应面图Fig 5 Response surface three-dimensional map of the encapsulation efficiency

2.3.1 Box-Behnken 响应面优化与分析 根据方程，绘制出每个因素对脂质体包封率影响的响应面曲面图，得出各个因素对满山红油脂质体制备的影响。对使用Design Expert 8.0.6 软件进行拟合作图得到的响应面图和等高线图进行对比，可明显看出每个因素和响应值及各因素间的交互作用［16］。之后进行计算，结果得出各因素的最优处方中卵磷脂与胆固醇的比例为7.28∶1、卵磷脂与药物的比例为11.34∶1、磷脂浓度为9.32 mg/mL。

2.3.2 验证试验 根据上述实验得出的处方，将最佳条件设置为卵磷脂与胆固醇的比例为7.28∶1、卵磷脂与药物的比例为11.34∶1、磷脂浓度为9.32 mg/mL。制成3 批满山红油脂质体样品，结果见表4。

表3 包封率回归模型系数的显著性检验结果Tab 3 Regression model coefficient of encapsulation efficiency of Folium Rhododendri Daurici oil liposome

由表4 可知，按照最佳条件进行的试验，所得的包封率的偏差绝对值较小，证实所建数学模型预测性良好。

表4 Box-Behnken 响应面优化法的验证（n=3，）Tab 4 Validation of the Box-Behnken response surface optimization method（n=3，）

表4 Box-Behnken 响应面优化法的验证（n=3，）Tab 4 Validation of the Box-Behnken response surface optimization method（n=3，）

注：偏差%＝（预测值-实测值）/预测值×100%。

载药量（%）5.84 6.07 5.92 5.94±0.12-批次12 3均值±标准差偏差（%）包封率（%）81.08 84.35 82.21 82.55±1.66+2.4%粒径（nm）154.6 131.3 105.7 130.53±24.46-PDI 0.203 0.229 0.124 0.185±0.05-Zeta 电位（mV）-23.5-20.9-21.5 21.97±1.36-

3 讨论

常规的脂质体制备方法有薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸发法等［17-19］，实验前期对3 种方法进行比较，薄膜分散法制备的脂质体粒度分布不均匀且包封率较低，洗膜时水化不完全且时间长，旋转蒸发时抽真空容易造成挥发油的散失，很难实现大规模生产；逆向蒸发法适合制备水溶性药物的脂质体，满山红油脂溶性大且制备的脂质体粒径较大，故不采用此制备方法；乙醇注入法操作简便，对实验仪器要求不高，制备的脂质体粒径均匀，包封率较高，重现性好，适合大规模生产［20］。

对脂质体进行超声乳化，可以将大单室脂质体转化为小单室脂质体，使得粒径减小，使得脂质体纳米粒融合造成的沉淀现象减小［21］。当溶液进行探头超声时，脂质体出现浑浊，超声后呈乳白色，粒径减小不明显，考虑是因探头温度过高破坏脂质体，因此，在超声时对脂质体进行冰浴，超声后脂质体透明有乳光，粒径较小、均一稳定。

本实验采用乙醇注入-探头超声法制备满山红油脂质体，以包封率为指标，进行单因素试验得出各因素的最优范围，然后以使用Box-Behnken 响应面法对处方工艺进行优化，得出最佳试验条件，结果表明：当卵磷脂与胆固醇的比例为7.28∶1、卵磷脂与药物的比例为11.34∶1、磷脂浓度为9.32 mg/mL，制备温度50 ℃，超声时间15 min 时，包封率最高，平均包封率为（82.55±1.66）%，通过验证试验证明3批脂质体各项指标的偏差较小，证明制备工艺稳定可行，通过制备满山红油脂质体，不仅使满山红挥发油的稳定性提高，还为开发新制剂提供了可能性。

作者贡献度说明

苏瑾：选题及实验技术指导，论文修改；王丽红：药材鉴定及成分测定；王庆伟：具体实验操作、数据处理、撰写论文；沈梦婷：实验材料的购买和数据分析；白丹妮：实验操作及数据收集与处理。