睾丸间质细胞线粒体调控睾酮合成的研究进展

常雪蕊，郭 勇，齐晓龙，陈 余，王 梁，盛熙晖，王相国，邢 凯，肖龙菲，倪和民

(1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.北京市畜牧总站，北京 100107)

睾丸间质细胞(Leydig cells,LCs)合成与分泌的睾酮是雄性动物最重要的雄激素之一，其可刺激雄性生殖器官发育成熟并维持其机能，促进精子的发生及成熟，促进蛋白质的合成，特别是肌肉、骨骼以及生殖器官蛋白质的合成，睾酮的合成还存在负反馈调节机制，以保证睾酮分泌处于相对稳定的水平[1]。鉴于睾酮的以上重要生理功能，调节睾丸间质细胞合成与分泌睾酮的研究越来越受到关注。近年来，大量研究表明，睾丸间质细胞合成分泌睾酮与线粒体密切相关，线粒体结构和功能的完整性直接影响睾酮的生物合成[2-4]。作者简述了睾丸间质细胞内睾酮合成的分子机制及影响睾酮合成的重要因子，并从线粒体结构、线粒体氧化损伤、线粒体调控的细胞调亡和线粒体的生物发生多个角度论述线粒体影响睾丸间质细胞合成睾酮的作用机制，旨在为进一步研究睾丸间质细胞中的线粒体影响睾酮合成的作用靶点及改善雄性动物睾酮分泌并提高其繁殖性能提供参考。

1 睾丸间质细胞与睾酮合成的机制及关键影响因子

1.1 睾丸间质细胞

睾丸间质细胞最早于1850年在大鼠中首次被发现并命名[5]，为分布在睾丸生精小管之间的疏松结缔组织，其主要功能是合成和分泌睾酮。尽管睾丸间质细胞在睾丸细胞中占比较少，但体内超过90%的睾酮是由睾丸间质细胞分泌的。哺乳动物睾丸间质细胞可分为胚胎期的胎儿型睾丸间质细胞(fetal Leydig cells,FLCs)和出生后生成的成熟型睾丸间质细胞(adult Leydig cells,ALCs)[6]。胎儿型睾丸间质细胞在胚胎发育期间就开始大量合成睾酮，此时的睾酮可以维持雄性生殖器官生长发育和胎儿大脑的正常发育。在胎儿出生后，胎儿型睾丸间质细胞数量下降，睾酮分泌与合成也随之下降。随着新生睾丸干细胞中成熟型睾丸间质细胞的发育，睾酮逐渐升高恢复至机体生长发育所需的正常水平[7]。目前，针对睾丸间质细胞开展的各项体内外研究均趋于成熟，为探究睾丸间质细胞的功能及其调控机制奠定了基础。

1.2 睾酮合成的机制

睾酮主要由睾丸间质细胞合成并分泌，其合成过程受下丘脑-垂体-睾丸轴(HPT)、转录因子和辅酶因子的调控。在下丘脑合成和释放的促性腺激素释放激素(GnRH)的刺激下垂体前叶释放能够刺激睾丸间质细胞合成睾酮的促黄体生成素(LH)。LH与睾丸间质细胞的膜受体结合，再与G蛋白偶联，刺激睾丸间质细胞激活腺苷酸环化酶使ATP转变为cAMP，进一步激活腺苷酸环化酶和蛋白激酶的表达,进而生成睾酮。同时睾酮的生成对GnRH、LH的分泌具有负反馈调节作用，使得机体内睾酮维持在正常的生理水平[8-10]。胆固醇是睾丸间质细胞合成睾酮的原料，位于线粒体外膜上的类固醇合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)能促进胆固醇向线粒体的内膜转运，随后在线粒体内膜胆固醇侧链裂解酶(cholesterol side-chain cleavage cytochrome,P450scc)的催化下生成孕烯醇酮，再通过光面内质网的羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)和转运蛋白(translocator protein,TSPO)的共同作用合成睾酮[9]。在体外试验中，在小鼠睾丸间质细胞(TM3)中添加75 μg/mL芹菜、金盏花的提取物能显著提高睾丸间质细胞的活力，增加睾酮的合成[11]。

1.3 睾酮合成的关键影响因子

位于线粒体上的StAR和P450scc是睾酮合成的关键限速酶[12]。通过调控StAR、P450scc和TSPO等关键基因和蛋白的表达可调控睾酮的合成[13]。如霉菌T-2毒素的抑制作用会降低P450scc和StAR的转录水平，导致小鼠睾丸间质细胞内睾酮合成减少[14]。给小鼠直接饲喂大豆油会提高睾丸间质细胞中类固醇合成StAR、P450scc蛋白的表达，使睾酮合成与分泌增加[15]。

1.3.1 StAR 类固醇合成急性调节蛋白StAR位于线粒体外膜，主要参与类固醇激素(胆固醇)的底物从线粒体外膜向线粒体内膜转运。研究表明，核转录因子(NRF1)可调控StAR的表达，在低氧血症或缺氧条件下，NRF1的下调可抑制StAR和睾酮的合成[16]。低氧诱导因子1(HIF1)与StAR启动子区域结合并抑制StAR的表达，降低睾酮的合成[17]。在男性生殖方面的研究发现，用适量的类黄酮和异类黄酮等物质可提高StAR的表达，进而促进睾酮合成[18]。

1.3.2 P450scc P450scc又称为CYP11A1,由CYP11A1基因编码，位于类固醇激素生成细胞的线粒体内膜上，主要作用是将进入线粒体的胆固醇转变为孕烯醇酮。睾酮合成的第一步是P450scc切割胆固醇侧链，也是至关重要的一步。 P450scc在所有类固醇生成细胞(包括睾丸间质细胞、肾上腺皮质细胞、卵巢细胞)中均有表达[19-20]。 如添加100 nmol/L双酚A(BPA)会通过上调大鼠睾丸间质细胞内P450scc基因及其蛋白表达来促进睾丸间质细胞增殖和分化[21]。研究发现，CYP11A1基因缺失会诱导小鼠睾丸间质细胞内脂质蓄积，进而影响睾酮的合成[22]，抑制CYP11A1和3βHSD的活性及表达水平可显著减少睾酮的合成[23]。

1.3.3 TSPO 转运蛋白TSPO是一种保守的线粒体外膜蛋白，在类固醇合成细胞中普遍存在，与多种细胞和组织功能有关，包括类固醇激素的生物合成、呼吸作用、细胞增殖和凋亡[24]。胆固醇是一种高度亲脂性的化合物，不能自由扩散，而TSPO对胆固醇有高亲和力可以促进其向线粒体内膜转运。TSPO与StAR结合后促进胆固醇向线粒体内膜转运并结合到P450scc上，是影响睾酮合成的关键步骤[25]。最近对TSPO的研究发现，缺失TSPO基因可直接影响小鼠StAR的合成与加工[26]。 敲除TSPO基因后，小鼠线粒体脂肪酸氧化程度和活性氧(ROS)含量明显增加，影响线粒体的能量稳态[27]。

此外，研究发现，添加1～10 nmol/L神经介素B7会增强猪原代睾丸间质细胞中关键蛋白(StAR、P450scc和3β-HSD)的表达，并显著促进睾酮的合成与分泌[28]。由此可见，位于线粒体中的StAR、P450scc和TSPO等是睾丸间质细胞调控睾酮生物合成的关键调节因子。

2 睾丸间质细胞线粒体与睾酮合成

线粒体是位于真核细胞细胞质中具有双层膜结构的细胞器，其特有的双层膜结构上分布着大量酶及酶复合体，是类固醇激素生物合成调控的关键控制点，只有在线粒体保持稳定的状态下睾丸间质细胞才能合成睾酮，而睾酮合成的关键限速酶StAR和P450scc的表达依赖于线粒体结构及功能的完整[29]。因此，睾丸间质细胞线粒体结构和功能的改变会直接影响睾酮的生物合成，线粒体损伤则会造成睾酮合成障碍，如不同浓度(1～200 μmol/L)尼古丁会造成小鼠睾丸间质细胞(TM3)的线粒体损伤，并且随着毒性的增加线粒体活性降低，最终造成睾酮生成障碍[30]。

2.1 线粒体结构与睾酮合成

胆固醇从细胞浆内转运到线粒体外膜，在StAR帮助下从线粒体外膜再转移至线粒体内膜，随后穿过线粒体内膜运输到线粒体基质内，通过P450scc复合物的作用在内质网内进行进一步合成代谢[31-32]。稳定的线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)、合适的pH和持续的ATP合成才能保证StAR发挥作用[33]。线粒体内膜两侧质子及其他离子的分布不均产生负电位差,即线粒体膜电位，而线粒体膜电位是驱动ATP合成的动力[34]。线粒体膜电位的变化会影响线粒体的功能，睾丸间质细胞内对线粒体膜电位产生影响的物质也会改变类固醇合成水平。研究发现，氧化后的低密度脂蛋白(oxLDL)通过破坏电子传输链并抑制睾丸激素合成相关的蛋白质和酶(StAR、P450scc和3β-HSD)来降低线粒体膜电位，最终导致线粒体功能障碍并减少睾丸间质细胞睾酮的合成[35]。

线粒体结构的改变同样也会对睾丸间质细胞中睾酮的合成产生影响。研究发现，长期暴露于静电场的睾丸间质细胞线粒体内外膜间隙扩大，会导致线粒体肿胀，线粒体膜破裂和缺陷，从而使睾酮合成和分泌减少[36]。如转录调节因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)在睾丸间质细胞中诱导类固醇生成酶的表达和睾丸激素产生中起重要作用，TAZ的缺乏会直接导致小鼠线粒体功能障碍和溶酶体功能失调，最终造成睾酮合成和分泌减少[37]。研究发现，在小鼠成熟的睾丸间质细胞中添加200 μmol/L 4-甲基儿茶酚可显著降低线粒体活性而减少睾酮分泌[38]。因此，线粒体膜电位及结构的改变会影响睾丸间质细胞进而影响睾酮合成。

2.2 线粒体氧化损伤与睾酮合成

线粒体呼吸链的氧化磷酸化系统主要由线粒体呼吸链酶组成。在电子传递链中起关键作用的酶分别是NADH氧化还原酶(复合体Ⅰ)、细胞色素b(复合体Ⅲ)和细胞色素C(CytC)氧化酶(复合体Ⅳ)[39]。线粒体在正常的新陈代谢过程中会生成ATP，同时产生氧负离子(O2-)。细胞中的氧负离子是ROS的前体，主要由呼吸链中的蛋白酶复合体Ⅰ、Ⅲ产生[40-41]。

正常情况下，ROS的浓度在机体内会保持稳态[42]，而在ROS浓度过高时就会造成氧化应激。氧化应激是影响睾丸间质细胞生殖功能的主要因素之一，线粒体作为氧化应激的主要靶点，易受到ROS的攻击，造成线粒体结构和功能的损伤并破坏睾丸间质细胞的类固醇生成能力[43]。过量的ROS会导致线粒体膜结构损伤，进而降低线粒体膜电位。线粒体膜电位参与ATP的合成、线粒体内的氧化还原反应和细胞增殖与凋亡等多种功能，同时维持线粒体膜电位的稳态也是线粒体氧化磷酸化发生必备的基础条件。因此，线粒体膜电位的降低会直接造成线粒体氧化损伤[44]。此外，细胞内ROS大量积聚可引起线粒体呼吸链的破坏，从而导致ATP生成减少[40]。大量体内外试验都表明，ROS会造成线粒体损伤，进而破坏睾丸间质细胞的结构和功能，诱导睾丸间质细胞凋亡，影响睾酮的生物合成，对生殖系统造成严重危害[45-46]。研究表明，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物1α(PGC-1α)是ROS的抑制因子，PGC-1α缺失的小鼠对氧化应激的敏感性增强，而提高PGC-1α表达可显著保护细胞免受氧化应激介导的死亡[47]。抑制山羊PGC-1α表达可降低调控睾酮合成StAR、P450scc等关键基因的表达，从而抑制睾丸间质细胞的睾酮分泌[48]。因此，调控ROS的产生，避免线粒体的氧化损伤，进而保护睾丸间质细胞促进睾酮合成与分泌，有望成为新的研究热点。

2.3 线粒体调控的细胞凋亡与睾酮合成

线粒体作为体内重要的代谢调节中枢，通过传递调节信号来控制细胞的功能，在细胞凋亡过程中具有重要的意义。线粒体不仅是细胞主要的供能细胞器，也是调控细胞凋亡的重要细胞器。细胞凋亡是细胞程序化死亡过程，是精确调节细胞数量和去除有害细胞(如被病毒感染的细胞和肿瘤细胞等)的主要途径[49]。尽管细胞凋亡的调控因物种的不同而有所不同，但在哺乳动物中，细胞凋亡主要通过线粒体进行调控，线粒体自身结构和功能的改变及外界环境的改变均可影响细胞凋亡[50]。

CytC存在于线粒体内膜外侧，参与线粒体呼吸链电子传递。同时，CytC也参与细胞凋亡过程，CytC由线粒体释放到细胞质内这一过程被认为是控制细胞凋亡的关键环节[51]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族(Caspase)是细胞凋亡特异性的蛋白酶，线粒体在此蛋白酶的激活中起着关键作用[52]。B细胞淋巴瘤-2蛋白家族(Bcl-2)包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，主要作用于线粒体外膜，通过调节线粒体膜孔隙进而调控促凋亡因子的释放，参与线粒体介导的细胞凋亡过程[53]。此外，由线粒体产生的ROS也可参与凋亡信号的传导。线粒体产生的ROS会随着时间而逐渐积累，最终导致DNA损伤、细胞凋亡[54]。因此，线粒体可通过调节睾丸间质细胞的凋亡而影响睾酮的合成与分泌。钙离子结合蛋白的过表达会降低线粒体相关凋亡因子(如Caspase-9和CytC)的表达，增强睾丸间质细胞的活力和增殖活性[55]。有研究表明，在大鼠的饮用水中添加1%牛磺酸可提高Bcl-2的表达并降低CytC和Caspase-3等蛋白的表达，增强线粒体内蛋白的抗凋亡活性从而抑制睾丸间质细胞的凋亡[56]。因此，通过线粒体途径调控睾丸间质细胞凋亡发生过早或过多均可降低睾酮水平，从而直接影响雄性动物的繁殖性能。

2.4 线粒体的生物发生与睾酮合成

线粒体的生物发生(mitochondrial biogenesis)是一个复杂的生物过程，指现有的线粒体通过线粒体数量的增加及酶活性的增强从而变成新的线粒体。线粒体中存在着机体细胞核及线粒体自身的DNA和RNA，所以线粒体的整个生物发生过程受细胞核基因组和线粒体基因组的双重调控。线粒体的生物发生伴随着线粒体大小、数量和质量的变化，同时通过促进线粒体氧化磷酸化和ATP合成改变线粒体的功能和结构[57-59]。

线粒体的生物发生是由多种因素引起的，如热量产生和氧化应激、细胞分裂和更新以及分化等，其受到来自激素、细胞内信号通路、核转录因子等的密切调控[60-61]。线粒体生物发生的最主要调节因子是过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物1α(PPARGC1A/PGC-1α)，激素、第二信使(钙离子、cAMP)和激酶途径(PKA、MAPK、PRKAA2)等均可通过调节PPARGC1A的表达、蛋白定位或翻译后修饰起调节作用[62-63]。在小鼠上的大量临床试验结果显示，PGC-1α的表达可调控线粒体DNA损伤通路，缺失PGC-1α基因的小鼠线粒体生物发生会受到直接影响[64]。多环芳烃苯并[a]芘(B[a]P)和二羟环氧苯并芘(BPDE)作为环境中广泛分布的污染物，可通过改变IRT1/TERT/PGC-1α途径抑制线粒体的生物发生，最终导致睾丸间质细胞内睾酮合成水平的下降[65]。胰岛素会影响小鼠睾丸间质细胞中线粒体生物发生的主要因子PPARGC1A及其下游靶基因线粒体转录因子(Tfam)的表达导致睾酮分泌减少[66]。此外，外界压力对大鼠睾丸间质细胞产生的应激反应可通过线粒体的生物发生来缓解，以保证睾酮的正常合成[67]。

3 小 结

综上所述，睾酮合成与睾丸间质细胞的线粒体结构和功能密切相关，线粒体氧化损伤、能量代谢、生物发生和线粒体凋亡等均可直接或间接影响睾丸间质细胞睾酮的合成与分泌。目前大量试验都已经证实通过不同的条件处理睾丸间质细胞会影响睾酮合成，但是线粒体影响睾酮合成的信号通路仍不明确，通过改善睾丸间质细胞中线粒体结构和功能促进睾酮合成的作用机制仍有待进一步深入研究。随着线粒体影响睾酮合成的作用靶点和作用机制的研究不断深入，将为研究雄性动物生殖内分泌的调控提供新的思路和途径。