Xist lncRNA介导X染色体失活及应用研究进展

陶维昆，刘 波，黄 飞，王 杰，高庆华，3

(1.新疆塔里木大学动物科学学院，阿拉尔 843300；2.新疆塔里木大学生命科学学院，阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300)

X染色体失活(X chromosome inactivation,XCI)作为表观遗传调控的一种重要且独特的机制，在雌性哺乳动物中可将一条X染色体包装成异染色质失去活性，使其基因功能受到抑制而沉默；在雌性哺乳动物中一条X染色体失去转录活性，一方面可平衡雌雄性间X连锁基因表达水平，防止出现过度表达情况；另一方面可平衡X连锁基因与常染色体间基因表达，上调有活性X染色体上的基因表达水平[1]。 X染色体失活中心(X chromosome inactivation center，XIC)是主要的调控区域，X-非活性特异性转录物(X-inactive specific transcript，Xist)位于该区域中，是调控染色体失活的主效基因。失活的染色体可诱导Xist编码长15～17 kb的长链非编码RNA(long chain noncoding RNA，lncRNA)，并在其上积累，同时招募其他因子对染色体进行修饰和沉默X连锁基因。近年来，随着Xist lncRNA的重要功能元件、RNA互作结合蛋白(RNA interaction binding protein，RBP)、下游染色体修饰和基因沉默途径等方面的新发现越来越多，XCI引起了研究者的广泛关注。对人、小鼠、兔和牛等物种研究发现，XCI在不同物种、不同时期及雌雄性胚胎之间存在差异[2-3]。此外，其与人类疾病也有关联[4-5]，如Xist lncRNA作为竞争性内源RNA(ceRNA)参与肿瘤和其他人类疾病的发展[6]。作为哺乳动物生物学基础的重要组成部分，XCI在整个生命过程中发挥着不可替代的作用。作者就Xist lncRNA介导XCI的主要分子机理、调控机制及在不同物种中的研究进行综述。

1 XCI发现与理论假说

1949年，Barr在雌猫有丝分裂间期神经细胞核中发现一种小体；1960年，Ohno等发现在雌性动物细胞中含有异常固缩的染色体[7]；1961年，Lyon等证实其为一条无转录活性的X染色体，且在细胞增殖过程中会向后稳定传递[8-9]。此后，研究者对这一生物学现象进行了总结[10]：①雌性哺乳动物细胞中仅有一条有转录活性的X染色体，另一条X染色体发生异常固缩而失活，其上大部分基因失去转录活性；②X染色体失活发生于胚胎早期发育过程中；③失活是随机发生的，可为父源遗传失活，也可为母源遗传失活；④失活的X染色体在细胞的有丝分裂过程中能够稳定地向后传递。 X染色体失活中心(X chromosome inactivation center，XIC)、长散在重复序列元件(long interspersed nuclear elements，LINE)、L1重复序列元件等在染色体失活过程中对X染色体基因抑制沉默发挥着重要作用[11]。

2 XCI调控机理

2.1 XCI的3个阶段

XCI是一种复杂的生物过程，伴随DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质凝缩、多种相关复合物富集等多种生物学变化[12]。简单来说，包括3个阶段：①起始阶段，细胞通过自主性表观遗传机制识别未来不活跃的X染色体，进而启动并触发在该X染色体上的Xist转录，并形成Xist lncRNA转录聚集；②建立阶段，Xist lncRNA覆盖到该X染色体上促使其大部分基因失去转录活性，从而抑制其转录；③维持阶段，失活的X染色体依旧能够合成Xist lncRNA用以维持自身的失活状态，在细胞经过多个分裂周期后，失活的X染色体经多次复制拷贝仍旧会保持这种失活状态被传递。当同一细胞核内其中一条X染色体被作为失活染色体传递时，另一条X染色体在传递过程则保持该转录活性状态被传递[13]。

2.2 Xist lncRNA在失活染色体上的扩散方式

Xist lncRNA结合到失活染色体上是X染色体失活的关键一步。目前关于Xist lncRNA在X染色体上结合与扩散方式仍存在不同说法。Gartler等[14]提出，可能存在一些站点式的位点促进和推动Xist lncRNA传播，使X染色体上的基因发生沉默。X染色体上富含LINE类型的分散重复元件很有可能就是这些位点[15]，Xist lncRNA与特定的位点进行跳跃式的结合，并从少数有限的募集位点向外传播可能是其中的一种模式。Xist lncRNA可能是利用染色体的空间结构，最先失活与Xist基因空间位置上较接近的基因，而后随着Xist lncRNA扩散至整条X染色体，最终使X染色体转录沉默[16-17]。Sunwoo等[18]在高分辨率显微镜下对小鼠单个细胞失活X染色体观察时发现，Xist lncRNA量比预测的要少，推测Xist lncRNA的传播可能存在着另一种“击-跑模式(hit and run model)”。Simon等[19]借助RNA序列靶点捕获杂交技术对4种处于不同阶段的雌性小鼠细胞检测发现，当X染色开始失活时，Xist lncRNA先扩散至整条即将失活的X染色体靶向基因的富集区，然后富集区向靶向基因贫瘠区进一步扩散；利用锁定核酸(locked nucleic acid,LNA)对小鼠胚胎成纤维细胞Xist lncRNA进行去除发现，Xist lncRNA会在几小时内重新覆盖到基因富集区和贫瘠区。因此，在维持阶段当XCI受到干扰时，细胞会自主启动应急机制，并短时间内迅速恢复至X染色体失活状态，不需要像最初失活时那样由富集区向靶向基因贫瘠区进一步扩散，这一发现表明在XCI起始阶段和维持阶段Xist lncRNA扩散方式可能存在差异。此外，X染色体上富含的一些特殊元素可协助Xist与Xist lncRNA介导的顺式传播沉默，这一关键元素再一次被指向X染色体上富含的LINE重复片段[1，19]。

2.3 Xist及其反义转录本(Tsix)在XCI调控中的作用

XIC作为主要的调控区域，不活跃的X染色体能够诱导XIC编码的多个lncRNA调控，包括Xist和Tsix等结合到XIC，进而富集更多的染色体修饰相关复合物，促使蛋白质沉积和形成异染色质构象[20]，从而抑制X染色体的转录活性。随着研究的深入，发现Tsix在XIC中位置与Xist重叠，Tsix介导抑制Xist的转录活性，但具体分子机制尚未完全明确。Tsix参与Xist启动子区组蛋白修饰状态的转换以及DNA甲基化酶Dnmt3a等的富集，然而在失活染色体的启动子和增强子处，通常组蛋白乙酰化程度较高，组蛋白H3K4me3较为丰富，并促进组蛋白H3K36me3的富集[21-22]。此外，失活染色体在一定程度上也促进了其他相关的组蛋白富集，如H3K27me3、H2AK119ub1、H3K9me2/3和变体组蛋白macroH2A[23-24]。对Tsix缺失的XY胚胎干细胞研究发现，胚胎早期发育过程中Xist基因表达呈显著上调趋势，Oct4、Nanog、Sox2等转录因子通过驱动Tsix的表达或抑制Xist激活因子Rnf12，从而抑制Xist[25]。Oct4通过与Tsix和Xist结合调控这一过程，胚胎干细胞中Oct4紧密结合在Xist基因内含子上，直至分化过程中会逐渐减少，同时结合到Xist上的Tsix会增多[26]。因此充分肯定了Xist与Tsix的反义调控作用，同时表明这一过程中还有其他多种物质和机制的参与。

2.4 Xist lncRNA参与介导XCI

Xist lncRNA与失活X染色体的结合使该条染色体转录活性明显降低，在这该过程中Xist lncRNA所募集的蛋白通过直接或间接的方式参与介导XCI基因沉默的发生，如转录抑制蛋白SHARP(又称SPEN)可能通过不同途径与Xist相互作用，募集组蛋白脱乙酰酶HDAC3、甲状腺激素受体SMRT[22]。在Xist lncRNA募集的成分中，数量最多的蛋白是核基质蛋白HndrnpK，它参与到PRC1和PRC2复合物的募集中，导致抑制标记物H2AK119ub和H3K27me3的沉积，从而促进沉默发生[23，27]。在失活X染色体上PRC2密度呈下降趋势，而后趋于稳定，而H3K27me3仍与Xist lncRNA的富集程度呈正相关[28]。由此说明，XCI过程中Xist lncRNA的丰富度与甲基化酶H3K27me3、多疏抑制复合体PRC2等存在密切互作机制。在X染色体异常固缩的活性转变过程中，Xist lncRNA聚集在失活染色体之后才发生H2A1.2的募集增加和组蛋白H4的低乙酰化，而H3-K9的甲基化与Xist lncRNA结合到X染色体几乎同步发生。说明在XCI过程中，Xist lncRNA募集的活性物质存在时序性积累和作用顺序。有研究认为，SPOC结构域是SPEN的一个关键区域，很可能是SPEN参与介导XCI并发挥作用的关键位点，但必须通过其他的HDAC3依赖途径促使XCI基因沉默发生；进一步研究发现，Xist lncRNA能够介导募集其他转录因子形成多梳抑制复合体PRC1、PRC2，并诱导组蛋白抑制标记物H3K27me3，同时消除RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)，从而保证CPG岛DNA甲基化和组蛋白变体macroH2A的沉积，共同参与维持已失活基因保持该沉默状态[28-29]。

3 染色体失活逃逸现象

由于X染色体上存在一些短的成对片段，这些片段若出现缺失或者重复会导致异常表型的发生，因此正常情况下X染色体上并不是所有基因都发生失活。位于X和Y染色体拟常染色质区域(pseudo-autosomal region,PAR)的成对基因可能存在失活逃逸现象[9]。研究发现，X染色体短臂远末端区域大多数X-连锁基因在胚胎早期发育过程中表现出稳定的转录失活特征，而少数未被沉默的基因主要存在于与Y染色体同源性较高的区域部分，此外游离在沉默区域之外的非同源区域中少部分基因也会存在免于失活现象[29-30]。失活染色体上约15%的基因不发生失活，这部分逃逸基因在个体、组织、细胞中失活状态各不相同[31]。逃逸基因启动子区的甲基化水平明显低于失活基因。在小鼠中通过敲除Dxz4和Firre基因可破坏失活染色体的空间结构，逃逸基因序列也随之发生改变[32]。

部分逃逸基因在组织间是相同的，而另一些则具有组织特异性。在成年老鼠组织中发现的失活逃逸基因与胎盘滋养层细胞中检测出的逃逸基因存在差异。胎盘滋养细胞中XCI为父源性印迹失活，由此提示印迹和随机失活间存在明显差异。失活X染色体上某些特定基因表达水平在组织间存在较大差异，进一步说明逃逸现象具有组织特异的剂量效应[33]。因此，XCI逃逸基因在不同组织和性别间的差异可能是男女性别差异的基础。目前，随着研究越来越深入，发现的逃逸基因数量也在增加，然而逃逸基因如何免于失活，其作用机制目前仍不清楚。

4 生殖细胞与早期胚胎XCI的发生

XCI能够稳定传递且在早期雌性胚胎细胞中随机失活，在这一过程中是如何发生呢？雄性哺乳动物生殖细胞形成过程中精原细胞减数第一次分裂时，同源染色体配对，父源X染色体上多数基因发生转录沉默(即印迹失活)，只有少数基因具备转录活性，因此精子中X染色体上大部分基因处于相对不活跃状态。随着受精的发生，父源X染色体活性会增强[31]。雌性哺乳动物中X染色体的变化表现为失活和复活的循环演变过程。雌性生殖细胞形成阶段，减数分裂时期失活的染色体被重新活化，且在分裂过程中能够稳定遗传和存在[34]。经减数分裂成单倍体细胞的过程中，每个单倍体的雌性生殖细胞都包含着一条具有转录活性的X染色体。而在受精卵形成初期，母源X染色体在母源印迹的保护下免于失活，继承了父本的X染色体会以基因印迹方式发生失活，而后在随机XCI启动前的囊胚期内细胞团中再次出现选择性地恢复活性，紧接着在胚胎内细胞团中父本和母本的X染色体才开始发生失活[35-36]，且这一次的失活完全随机。研究发现，在X染色体重新复活过程中靠近Xist的基因复活得最晚[37]，且X染色体活化的同时，其表达水平出现一定程度上调，同时促进常染色体表达比率上升[38]。当失活染色体表现复活现象时，细胞内Xist基因会保持沉默状态，同时组蛋白抑制标记物也会一起消失，直至复活完成和再次失活开始[39]。

5 不同哺乳动物中XCI的研究

5.1 小鼠XCI

对小鼠早期胚胎研究发现，XCI的模式在哺乳动物中似乎并不保守，胚胎细胞在2-～4-细胞期父源X染色体表现出印迹性失活特征；囊胚胚泡阶段内细胞团中失去转录活性的X染色体被重新激活，两条X染色体都具备转录活性；直至囊胚后期着床过程中伴随着内细胞团的分化，上、下胚层细胞X染色体随机失活机制被再次激活，而外胚层滋养细胞则一直保持父源X染色体失活[40-41]。对小鼠胚外绒毛组织研究发现，母源X染色体具备活性，而父源X染色体保持失活状态，推测这种现象可能是为避免胚胎着床过程中受到母体免疫攻击[42]，且该现象只在小鼠中发现。

Oh等[43]研究发现，分化过程中小鼠胚胎干细胞(mESCs)JPX基因编码的lncRNA对Xist的转录有激活促进作用，Xist P2启动子上的绝缘子结合蛋白(CTCF)被游离出来以解除CTCF对Xist转录的抑制作用，从而促进Xist的表达使XCI正常进行，进一步敲除JPX基因发现，其对雌性的胚胎干细胞具有致死性。Nesterova等[44]研究发现，小鼠17号和7号染色体基因簇的亲本印迹分别需要Airn和Kcnq1ot1基因座，它们通过一种类似于Xist的机制在Polycomb复合体的长期募集中发挥作用。在hnRNPK诱导作用下，Airn和Kcnq1ot1基因座的lncRNA在滋养层干细胞中形成跨越数百万个碱基的染色质修饰的多复合顺式结构域，且修饰程度与lncRNA基因座邻近的基因组结构有关，也与lncRNA本身的丰度相关[45-46]。对着床前小鼠胚胎和胚胎干细胞研究发现，SPEN不但对X染色体基因沉默发挥积极作用，而且参与维持神经细胞中XCI，同时SPEN逃避对XCI基因的表达有明显的抑制作用；SPEN在Xist上调后立即被募集到X染色体，并靶向迁移到活性基因的增强子和启动子区；基因沉默后SPEN从染色质上迅速脱离，表明SPEN在染色质上的结合是需要主动转录的；此外研究人员认为SPOC结构域是SPEN基因沉默的主要效应物，并证明SPOC与Xist RNA的结合足以介导基因沉默[29]。Patrat等[47]鉴定了SPOC的蛋白质伴侣，包括NCoR/SMRT、m6ARNA甲基化酶、NuRD复合物、RNA聚合酶Ⅱ以及参与转录起始和延伸调控的其他因子，推测SPEN可能充当XCI起始的分子整合剂，在活性增强子和启动子区域使得Xist lncRNA与转录调控、核小体重塑和组蛋白去乙酰化酶连接在一起，SPOC在该过程中与SPEN共同发挥生物学功能。

5.2 人XCI

近年来，关于人早期胚胎干细胞(hESCs)的形态特征、转录组、表观基因组特征、XCI分子特性等方面研究发现，人和小鼠胚胎干细胞移植后外胚层有类似的多能性状态，但人植入后胚胎外胚层细胞和植入前囊胚期胚胎干细胞与小鼠存在差异，表明XCI在哺乳动物中具有物种特异性。由于受XCI影响，在X连锁基因甲基化CpG结合蛋白2(MeCp2)中，分别用绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白tdTomato标记X染色体(Xa-GFP和Xi-tdTomato)，结果发现，人胚胎着床前囊胚内细胞团中大多数细胞两条X染色体保持活性且转录较活跃，大部分细胞中检测到Xist双等位基因表达[48]。着床前hESCs外胚层转录组中也检测到高水平TFCP2L1和Xist双等位基因表达。人早期胚胎中XCI分别开始于桑椹胚至囊胚阶段，且不受印迹的影响，此外，在人胚胎ICM中检测到Xist转录物在X染色体周围出现聚集现象，说明此时正在发生着XCI[49]，进一步证实XCI在哺乳动物中具有物种特异性。然而目前人类这方面的研究模型不够完善，缺乏理想的系统来研究人早期胚胎发育过程中的X染色体调控机制，因此人XCI的机制尚不明确[50]。

5.3 牛、羊等其他物种XCI

XCI机制研究表明，组蛋白H3K27me3能够促进Xist表达和XCI发生。研究发现，在牛早期胚胎桑椹胚期前后均能检测到Xist和组蛋白H3K27me3大量表达，在发育第7天的囊胚中也检测到Xist lncRNA与组蛋白H3K27me3，第9天表达量仍没有出现下调，另外在ICM和外胚层前体中也检测到一定比例的细胞具有Xist lncRNA和组蛋白H3K27me3[51]。此外，JPX RNA通过游离CTCF来激活Xist,从而促进XCI发生，在牛早期胚胎发育过程中，当JPX RNA水平受到干扰后Xist的表达会下调，进而使PGK1、DYNLT3和MSN的表达随之上调[52]。研究发现，在牛早期胚胎发育不同阶段(2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚)JPX和Xist都有表达，2-细胞期表达水平很低还未能量化，且随着胚胎发育相对表达量逐步升高，尤其在桑椹胚阶段显著上调；在不同性别牛胚泡中雌性Xist基因和X连锁基因表达水平更高，推测X染色体似乎还未完全失活，表明XCI在牛上可能开始于4-细胞到桑椹胚期[53]。何杰[51]对牛胎儿心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织中JPX和Xist的相对表达量检测发现，JPX和Xist在雌性胎儿组织中的相对表达量显著高于雄性胎儿组织，说明此时不同性别和不同组织间XCI已经完成并维持稳定状态[52]。研究提出，小鼠和牛早期胚胎胚外组织中可能发生印迹XCI，而人、马、兔和猪等在发育过程中只发生随机XCI；Xist基因可能在牛精子细胞中表达，但没有发现甲基化[54]，具体仍有待进一步研究证实。

目前，在绵羊上也发现了XCI现象，随着绵羊基因组测序的完成和RNA-Seq技术的进步，为探究绵羊的X染色体剂量补偿和X连锁基因表达提供了新的思路和方法[55]。此外，在小鼠性别鉴定中发现，转录SRY基因的睾丸细胞及雄性胚胎从受精卵发育至囊胚的过程中几乎不转录Xist基因；无SRY基因的雌性卵母细胞和雌性胚胎从合子开始到发育至2-细胞的过程中Xist基因不发生转录，然而从4-细胞期开始到囊胚期雌性细胞始终保持Xist基因转录活性[56-57]。吴霄[57]在探究Xist基因甲基化水平对猪体细胞核移植胚胎克隆效率时发现，Xist基因甲基化水平越低，克隆团囊胚率越高，呈高度负相关，小鼠中也有相似的情况发生。但羊XCI进程中是否也存在与猪、小鼠相似的情况，还需要进一步去探索。

6 小 结

XCI作为雌性哺乳动物一种独特的发育调控机制和表观遗传调控模式，由Xist与Tsix主要调节因子介导，通过DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传修饰调控整个生理过程，对哺乳动物正常生长发育进程意义重大。对人、小鼠、兔和牛等XCI研究表明，其调控机制和分子机理复杂，具有种间特异性，而且似乎没有遵循统一的模式，同时诸多数据显示，不同物种间X连锁基因在XCI启动后的下调保守性并不一致。值得注意的是，胚胎基因组在小鼠2-～4-细胞期、在人4-～8-细胞期、在兔和牛8-～16-细胞期被激活，由此推测哺乳动物XCI的启动紧跟着胚胎基因组的激活。同时，XCI这一良好的表观遗传学研究模型对于临床疾病治疗具有一定的指导意义。在临床研究中,XCI的程度与临床疾病如X连锁显性遗传Alport综合征、性别特异性流产、Rett综合征、Menkes病及染色体有关疾病等存在联系[10]。目前Xist lncRNA被证实参与多种类型肿瘤发展，包括脑肿瘤、白血病、肺癌、乳腺癌和肝癌，在人类疾病特别是癌症方面起着重要调节功能，并有望用作新的诊断和预测标志物[58]。

Xist lncRNA是表观遗传调控中发挥功能的经典范例，尽管其在很大程度上仍无法全面解释XCI机制，但这方面的研究对基因沉默、异染色质结构和细胞核构成、性别特异性差异产生的机理及遗传上可能出现的假显性等方面有更全面的了解。目前这些机制在小鼠和人上研究较多，但在家养哺乳动物上的研究相对滞后。建立XCI的理想体系模型和表型、分子量化分析能够加快认识哺乳动物种间特异性特征与XCI之间联系。随着单细胞RNA-Seq技术的分析效果越来越强，借助高通量技术了解X染色体基因调控和XCI调控机制将成为新的研究助力。