白藜芦醇调控细菌耐药性研究进展*

刘柯，石瑾，丁军颖

1.首都医科大学附属北京中医医院/北京市中医药研究所/中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室，北京 100010；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010

由于我国部分地区抗生素使用尚不规范，使抗生素对耐药菌疗效乏力的同时反倒成为其耐药进化的动力，致使多耐药、泛耐药菌频现，甚至出现极度耐药的“超级细菌”[1]。临床上，耐药菌感染常因抗生素治疗无效而进展至重症，甚至死亡[2]。因此，迫切需要开发不易引起细菌耐药的非抗生素新药。近年来，中草药以其能延缓细菌耐药出现时间，甚至逆转细菌耐药的特性而备受关注[3]。白藜芦醇在植物体内以虎杖苷的形式存在，也是中药虎杖的核心活性成分。白藜芦醇对革兰氏阴性及阳性菌[4-8]、病毒[9-10]、真菌[11]及衣原体[12]等抑制作用明确，尤其可通过干扰细菌生物膜的形成、抑制药物外排泵的功能、增加细胞的通透性及修饰药物作用的靶点等参与细菌耐药的调控。此外，白藜芦醇还可作为抗菌增效剂增加细菌对抗生素的敏感性，提高抗生素的疗效。本文将对白藜芦醇调控细菌耐药性的相关机制予以综述，以期为抗感染中医药的研发、耐药菌感染的诊治提供新思路。

1 细菌感染的治疗困境——耐药

近年来，我国耐药菌的检出率逐年攀升。相关细菌耐药数据表明，金黄色葡萄球菌对青霉素G的耐药率高达93%，大肠埃希菌对氨苄西林耐药率也高达88%，鲍曼不动杆菌对头孢曲松、头孢他啶耐药率在70%以上[13]。最新的全国细菌耐药监测网数据显示，2020年碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌、碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌及泛耐药甚至全耐药的鲍曼不动杆菌等革兰氏阴性菌的检出率仍处于较高水平[14]。可见，细菌耐药目前已成为国内医学界亟待解决的重大科学问题。

面对防治细菌耐药的困境，现代医学以回复突变为主要理论依据，通过不断升级抗生素提高疗效，但结果并不十分理想：因新型抗生素研发多滞后于耐药菌的出现，存在诱发新耐药菌株的风险。几乎每种新型抗生素问世不久，针对该抗生素的耐药菌就会随即出现，以致抗生素使用期限越来越短。尤为重要的是，抗生素用量增加也是细菌耐药性增强和对抗生素选择压力升级的主要原因，即耐药菌产生的根源就是抗生素[15]。研发不易耐药的非抗生素新药迫在眉睫，而中药因不易引起细菌耐药的特性而备受关注。

2 白藜芦醇抑菌作用明确，抑菌谱广泛

白藜芦醇具备中药不易引起耐药的共同特性，且来源丰富。在虎杖地下根及根茎中含量很高，也广泛存在于藜芦、何首乌及花生、葡萄等其他植物中。自然界中，当植物遭遇病原侵害时，白藜芦醇会应激性合成增加而抵御病原，故有“植物抗菌素”之称[16]。白藜芦醇主要以虎杖苷的形式存在于虎杖根茎中。虎杖苷是白藜芦醇的糖苷形式，在糖苷酶作用下可转化为白藜芦醇。二者具有相似的抑菌作用，包括抗炎、抗病毒、抗菌和抗氧化等。将虎杖根茎中的虎杖苷高效转化为白藜芦醇，是目前获取白藜芦醇的主要方法[17]。

白藜芦醇对革兰氏阴性及阳性菌均有明确的抑制和杀灭作用。研究发现，白藜芦醇能通过减少角膜上皮细胞受体蛋白TLR2的含量，使金黄色葡萄球菌诱导促炎因子表达和分泌减少[4]。研究亦表明，白藜芦醇可干扰肠球菌细胞壁的合成，从而使菌体扭曲变形，致使肠球菌裂解死亡[5]。另外，也可通过下调主导细胞分裂的关键蛋白ftsZ的表达，使大肠杆菌处于生长抑制状态[6]。此外，研究发现，白藜芦醇以浓度依赖性的方式显著抑制霍乱弧菌[7]和铜绿假单胞菌[8]生物膜的形成，降低细菌的耐药性。

白藜芦醇对病毒、真菌及衣原体亦有抑制效果。白藜芦醇通过调控核糖体功能，阻断病毒蛋白的翻译，从而抑制流感病毒和呼吸道合胞病毒复制，显示出对流感病毒、呼吸道合胞病毒的显著抗病毒活性[9]。值得一提的是，与洛匹那韦/利托那韦相比，白藜芦醇还能更有效地阻碍新型冠状病毒的复制[10]。另外，白藜芦醇还可提高白色念珠菌的活性氧水平，致使线粒体损伤，从而诱导白色念珠菌的细胞凋亡[11]。而且白藜芦醇可通过降低肺炎衣原体感染细胞中IL-17和IL-23的产生，对衣原体显示出明确的生长抑制作用[12]。总之，白藜芦醇抑菌作用明确，且对微生物的抑制范围广泛，深层机制值得进一步探索。

3 白藜芦醇调控细菌耐药性的可能机制

3.1 干扰生物膜形成生物膜作为抗菌药物向菌体内渗透的天然屏障，可阻碍抗生素向菌体内的扩散，降低菌体内抗菌药物浓度，增强细菌耐药性；还可导致膜内营养不足，迫使细菌通过基因调控等方式降低自身代谢水平，甚至进入休眠状态，最终导致细菌对药物的敏感性降低[18]。因此，生物膜相关的细菌耐药性主要是由抗生素的渗透障碍及膜内细菌生长速度减慢所致。生物膜是细菌对抗生素产生耐药，导致耐药菌感染性疾病迁延不愈的重要原因，抑制或破坏细菌生物膜可有效降低细菌耐药性。

白藜芦醇对细菌生物膜的干扰作用涉及多个层面。首先可通过群体感应调控系统干预生物膜的形成。谭宏亮等[19]发现64 mg·L-1的白藜芦醇对嗜水气单胞菌生物膜抑制率可达40.5%，逆转录聚合酶链反应结果进一步证实，白藜芦醇通过上调嗜水气单胞菌Ⅰ型群体感应调控系统的luxR基因表达，下调Ⅱ型群感调控系统的luxS基因表达，继而影响嗜水气单胞菌生物膜形成，最终实现对细菌耐药性的调控。白藜芦醇还可通过调节双组分系统抑制生物膜的形成甚至可清除大肠埃希菌已形成的生物膜。蛋白质组学结果显示，白藜芦醇通过调节双组分系统中的蛋白表达水平，尤其是趋化蛋白CheY、CheZ抑制生物膜的形成[20]。另外，白藜芦醇还可通过减少膜蛋白和胞外多糖含量，抑制生物膜的形成。据报道，白藜芦醇下调编码外膜蛋白合成相关基因w、yedS、ompK的表达的同时，细胞膜蛋白及胞外多糖含量减少，生物膜的黏附及合成明显被抑制，生物膜结构趋于松散，最终实现对细菌耐药性的调控[21]。此外，白藜芦醇通过影响细菌鞭毛抑制生物膜的形成。随着白藜芦醇质量浓度的增大，蜂房哈夫尼菌生物膜逐渐裂解，迁移距离逐渐缩短[22]。此机制与胞内第二信使环二鸟苷酸(cyclic diguanylate，c-di-GMP)系统有关，c-di-GMP参与调节细菌的多种生理功能，包括细菌游动性和生物被膜形成等[23]。白藜芦醇通过调控c-di-GMP系统影响细菌游动性，从而干扰细菌生物膜形成，进而降低细菌耐药性。

总之，白藜芦醇可通过影响群体感应调控的基因表达，调节双组分系统中的趋化蛋白水平，下调表达编码外膜蛋白合成的相关基因，调控胞内第二信使c-di-GMP系统等影响细菌生物膜的形成，最终实现对细菌耐药性的调控。

3.2 抑制外排泵功能外排泵系统可将胞内药物排至胞外，通过降低菌体内有效药物浓度阻碍药效发挥，使细菌呈现耐药性。因外排泵可非特异性外排多种抗生素[24]，所以常使细菌产生多耐药、泛耐药性。因此，抑制细菌外排泵功能是调控细菌耐药，尤其泛耐药、多耐药的有效途径，积极寻求细菌外排泵抑制剂是可能的治疗策略。

白藜芦醇可通过抑制外排泵功能延缓细菌耐药的出现。据报道，AcrAB-TolC是大肠杆菌最重要的外排泵，白藜芦醇通过下调TolC的表达可有效抑制AcrAB-TolC的外排功能，且可剂量依赖性阻断。白藜芦醇可显著降低TolC启动子活性，从而显著下调TolC的表达，最终实现AcrAB-TolC对药物的主动外排抑制[25]。AdeABC外排泵可非特异外排多种抗菌药物，是鲍曼不动杆菌泛耐药的直接原因。据报道，白藜芦醇可显著抑制AdeABC外排泵的表达，增加鲍曼不动杆菌对氯己定的敏感性，同时成倍降低氯己定的最低抑菌浓度[26]。此外，ATP介导的多药耐药蛋白是导致细菌多药耐药的另一主要原因。由多药耐药基因编码的P-糖蛋白可通过ATP水解释放能量，将药物泵出以降低胞内药物浓度，从而使细菌产生耐药性[27]。反式白藜芦醇及其糖苷化合物则可有效抑制P-糖蛋白的泵出，逆转其耐药性，尤需注意的是低剂量对细胞基本无毒性作用，但逆转耐药作用却非常显著[28]。总之，白藜芦醇是一种有效的外排泵抑制剂，可有效改变细菌耐药性。

3.3 增加细胞通透性临床耐药菌感染因抗生素疗效乏力而成为全球医学界的难题，尤其多重耐药的革兰氏阴性菌感染率较高[29]。它具有独特的外膜结构，可有效屏蔽抗生素，是调节细胞通透性和抗生素耐药的关键结构。外膜低渗透性与外排泵具有协同作用，已有证据证实二者共同导致了革兰氏阴性菌的耐药窘境[30]。另外，在革兰氏阳性菌中，细胞壁及细胞膜通透性也是影响其耐药的主要因素。

白藜芦醇可通过抑制编码外膜蛋白基因，下调外膜蛋白表达，增加革兰氏阴性菌的外膜通透性，使抗生素顺利进入菌体内，进而调控其耐药性[31]。就革兰氏阳性菌而言，白藜芦醇可通过增加其细胞壁及细胞膜的通透性，使药物进入菌体，继而干扰核酸、蛋白质等阻碍细胞器的合成，导致细胞器破坏和/或结构溶解，进而影响耐药菌的生长代谢。据报道，白藜芦醇可阻碍细胞壁的肽糖聚合所需的糖肽基和转肽反应，抑制肠球菌细胞壁的合成，使肠球菌结构破坏，胞壁破损，细胞器结构模糊，胞质内含物消失或呈现空泡样改变，从而增加细胞通透性，提高抗菌药物通过率，进而解决细菌的耐药性问题[5]。另外，白藜芦醇还可通过调控NF-κB信号通路改变革兰阳性菌的通透性，甚至通过呼吸道上皮细胞分泌的具有天然抗菌活性的免疫蛋白—短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate，lung and nasal epithelial clone 1，SPLUNC1)蛋白，调节离散小孔的形成，增加细菌细胞膜通透性。尤其白藜芦醇作为天然的SIRT1激活剂，可通过抑制NF-κB炎症信号通路，下调相关炎症因子表达，影响SPLUNC1的分泌，从而增加细胞膜通透性，进而影响抗菌药物的通过率，最终实现改变细菌耐药性的效果[32]。

3.4 改善药物作用靶点抗生素作用靶点的改变是细菌耐药的另一重要机制[33]：①新型靶蛋白的产生：细菌与抗生素接触之后产生新的靶蛋白，使抗生素不能与其有效结合，从而降低抗生素的亲和力，产生耐药性；②靶蛋白数量的改变：靶蛋白数量的增加使抗生素存在时仍有过量靶蛋白，维持细菌的生长增殖；③作用靶点的丢失：靶点丢失直接导致抗菌药物不能与其结合而失效，以铜绿假单胞菌为例，lpxC或lpxO2基因突变，使脂质A的生物合成障碍，多黏菌素作用靶点丢失，导致铜绿假单胞菌对多黏菌素的耐药性显著增高[34]。

白藜芦醇可通过修饰药物作用靶点而改善耐药菌的感染。据报道，白藜芦醇可通过影响甲基化和乙酰化酶的表达，可改变启动子组蛋白的表观遗传修饰——进而降低甲基化水平，增加乙酰化水平，最终影响耐药菌的致病性[35]。另外，白藜芦醇作为非选择性腺苷的受体激动剂，还可通过靶向作用质膜的腺苷受体，影响基因转录、受体表达及下游腺苷酸环化酶AC/PKA的活化通路[36]，甚至通过增加AMPKα的磷酸化水平抑制NF-κB信号通路，进而下调其下游药物外排泵——P-糖蛋白的表达，降低其细菌耐药性[37]。白藜芦醇还可通过结合并还原铜离子，生成氧化铜复合物和活性氧，破坏质粒DNA的完整性，导致大肠杆菌的细胞周期显著阻滞[38]。另有研究表明，白藜芦醇亦可直接刺激线粒体，诱导鼠伤寒杆菌的氧化应激反应，提高NADPH氧化酶活性，产生大量活性氧，上调抑制蛋白的表达，导致DNA损伤，从而促进细胞凋亡[39]。总之，药物作用靶点的不同修饰均可影响细菌对靶向药物的敏感性，基于此，白藜芦醇相关药物的开发颇具前景。

3.5 抗菌增效剂抗菌中草药常作为增效减毒剂与抗生素联用[40]，降低抗生素细胞毒性的同时，可增加细菌对抗生素的敏感性；也可在提高抗生素药效的基础上，有效延缓细菌的耐药时限。本课题组前期研究发现，芪归银方作为扶正透邪的代表方剂，可通过改变参与细菌生物膜形成的ArcA和IscU等蛋白的表达水平来调节铜绿假单胞菌的耐药性，一定程度上恢复耐亚胺培南的铜绿假单胞菌的敏感性[3]，提示中草药作为抗生素增效剂的潜在可能。白藜芦醇和虎杖苷在一定条件下可相互转化，两者皆是中药虎杖的核心生物活性成分，虎杖亦是芪归银方的关键药味。因此，在确证芪归银方协同抗菌疗效基础上，需进一步关注白藜芦醇或虎杖苷的抗菌抑炎机制。

已有研究证明，白藜芦醇可增强抗生素对耐药菌的消杀作用。以对多黏菌素B耐药的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌为例，研究发现二者对多黏菌素B的最低抑菌浓度因添加白藜芦醇而显著下降，下降程度与白藜芦醇浓度呈剂量依赖性[41]。陈尚岳等[42]研究发现，白藜芦醇与苯唑西林、环丙沙星联用时，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用均显著增强。细胞毒性实验进一步表明，环丙沙星或苯唑西林单用时，小鼠细胞的存活率分别为93.8%和94.5%，联用白藜芦醇后，细胞存活率分别增至95.3%和96.1%，说明白藜芦醇作为抗生素的增效剂，不仅提高了抗生素药效，还降低了抗生素的细胞毒性作用。另据报道，白藜芦醇与抗生素联用还可显著抑制耐药菌生物膜的形成，使细菌耐药性和致病性均明显减弱：与万古霉素联用时，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的抑制率从单用时的27.71%增至55.43%[43]。白藜芦醇甚至可通过下调铜绿假单胞菌群体感应调节系统中lasI和rhlI基因的表达，增强氨基糖苷类抗生素对铜绿假单胞菌生物膜的抑制作用，即恢复对氨基糖苷类抗生素的敏感性，这均有力证实白藜芦醇与抗生素对耐药菌的协同疗效[8]。

综上所述，耐药菌感染日益严峻，在抗生素对耐药菌疗效乏力的背景下，基于中药不易引起耐药的特性，成分明确的中药单体联合抗生素的协同治疗可能是应对耐药菌感染的潜在方法。

4 结论与展望

抗生素的杀菌抑菌疗效毋庸置疑，但随着细菌耐药状况的加重，使抗生素非但不能有效抗菌，反倒成为细菌耐药的动力，因此，研发不易引起耐药的新型非抗生素药物势在必行。白藜芦醇治疗耐药菌感染有多重优势：①具备中药不易引起细菌耐药的共性，且较中药复方成分更明确；②白藜芦醇以虎杖苷的形式广泛存在于虎杖及其他植物中，易获取；③其部分抑菌作用已得到证实，且抑菌谱广泛；④抑菌机制多样，包括干扰生物膜形成、抑制外排泵功能、增加细胞通透性、改善药物作用靶点等；⑤可协同增效抗生素，实现对细菌耐药特性的有益调控。以上多着眼于细菌的耐药机制阐述，然而，结合中药免疫调理特点阐释白藜芦醇对细菌耐药机制改变的报道尚不多见，尤其是结合HMGB1这一免疫网络核心调控分子的研究尚不够详尽，值得进一步探索。

已知虎杖是芪归银方的关键药味，虎杖苷是白藜芦醇的糖苷形式，二者均是虎杖的核心生物活性成分。本课题组前期已证实，芪归银方所有组分均无明显毒副作用，为白藜芦醇、虎杖苷等单体药物开发的安全性奠定了基础[44]。另有报道，白藜芦醇及虎杖苷胃肠道吸收均良好[45]，为其给药方式及临床口服剂型的探索提供了保障。上述研究均提示基于病原体/机体免疫，全面揭示了白藜芦醇调控细菌耐药机制的单体中药研发的迫切必要及潜在可能。