咖啡因治疗早产儿呼吸暂停相关基因多态性的研究进展

谢江彪 综述 林新祝 审校

（厦门市妇幼保健院（厦门大学附属妇女儿童医院）新生儿科/厦门市围产-新生儿感染重点实验室，福建厦门 361001）

1 早产儿呼吸暂停

早产儿呼吸暂停（apnea of prematurity，AOP）是指胎龄＜37周的早产儿呼吸停止时间≥20 s，或不足20 s 但伴有心率下降（＜100 次/min）、出现青紫或苍白［1］。AOP 的发生主要与呼吸控制系统的发育不成熟有关，发病率与胎龄和出生体重呈负相关。据报道，胎龄＜28 周和出生体重＜1 000 g 的早产儿几乎都有AOP 的相关症状，胎龄为30 周、34周和＞34周的早产儿AOP发生率分别为85%、20%和10%；出生体重＜1 500 g 和＜2 500 g 的早产儿AOP发生率分别为53.7%和25%，一定程度上，早产儿胎龄和出生体重越低，呼吸中枢发育越不成熟，越容易发生呼吸暂停［1-4］。

研究发现，AOP 不仅与呼吸中枢发育程度相关，遗传因素也参与了AOP 的发病。2003 年的一项研究显示，父母为一级近亲结婚的早产儿AOP患病率增高（OR=2.9，95%CI：1.3～6.4），首次表明了遗传因素在AOP 发病中的重要作用［5］。一项单中心的回顾性研究纳入了317 对胎龄＜37 周的双胞胎，发现在同性别的双胞胎中AOP 的遗传效应占87%（95%CI：0.64～0.97）［6］。Kumral 等［7］研究发现，AOP 的发病与早产儿携带的腺苷受体基因有关。因此，AOP 这种与呼吸控制系统发育相关的疾病同时具有重要的遗传基础。

2 咖啡因治疗AOP的个体差异

甲基黄嘌呤类药物，如咖啡因、茶碱、氨茶碱是治疗AOP 的主要药物，咖啡因与其他甲基黄嘌呤类药物相比，其半衰期长、治疗窗广、不良反应少、生物利用度高且通常不需要监测血药浓度［8］，现已成为治疗AOP 的首选药物。一项咖啡因治疗AOP 的大型随机对照研究，已经证明了标准剂量枸橼酸咖啡因（负荷剂量20 mg/kg，维持剂量为每日5 mg/kg）的安全性和有效性［9］，但实际临床中发现，在相同的治疗方案下，一些患儿对咖啡因疗效不佳，使用咖啡因后仍然存在频发的呼吸暂停［10-11］，需要更高剂量的咖啡因或必须联合正压通气支持治疗。Rosen 等［12］纳入66 名胎龄＜33 周的早产儿，其中36 名对7.5 mg/kg 维持剂量的枸橼酸咖啡因无反应，需进一步增至10 mg/kg。我国一项研究纳入78 名极低出生体重儿，发现10 mg/kg 维持剂量枸橼酸咖啡因与5 mg/kg 相比有效 率 更 高（71% vs 48%，P＜0.05）［13］。Mokhtar等［14］对43 名AOP 患儿的研究显示，18 名对咖啡因反应良好，使用咖啡因后呼吸暂停次数显著减少，25 名对咖啡因治疗无反应，用药后呼吸暂停频率减少不足50%或必须联合正压通气治疗。这表明咖啡因治疗AOP 的疗效存在个体差异。咖啡因是世界上使用最多的精神活性物质，对中枢神经、呼吸、心血管等多个系统产生影响，有缓解疲劳、提高警觉、改善运动性能等功效［15］。在成人中，不同个体对咖啡因的敏感性不同，使用咖啡因后的效应存在个体差异，人们已经发现遗传变异是引起这种差异的一个重要来源［16］。因此，遗传变异可以解释咖啡因治疗AOP 患儿疗效的个体差异。

3 咖啡因治疗基因组学研究现状

随着分子生物学的发展，对于咖啡因治疗的研究已经达到基因层面。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是由基因组DNA序列中单个碱基的转换或颠换所形成的变异，是人类遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。基因多态性尤其SNP 对咖啡因治疗AOP疗效的影响已成为近年来研究的热点。

如前所述，AOP 的患病受到遗传因素的影响，且观察到在相同治疗方案下咖啡因对一些AOP 患儿治疗效果不佳，需要更高剂量或联合呼吸支持，表明该药在早产儿中存在疗效的个体差异性。为了提高咖啡因使用的安全性和有效性，有必要对影响其疗效的遗传因素进行分析。目前关于咖啡因治疗AOP 疗效的研究基因达20 余种。主要针对以下3个方面的基因：（1）咖啡因作用受体相关基因，包括4种腺苷受体基因；（2）咖啡因代谢相关基因，包括6 种CYP基因、AHR基因；（3）与咖啡因作用相关的其他14 种基因，包括9 种PDE基因和ADA、CLOCK、BMAL1、AHRR、ARNT基因。 其 中ADORA1、ADORA2A、ADORA3、PDE4D、AHR、ADA、CLOCK基因与咖啡因疗效密切相关，且研究也较为深入。

3.1 咖啡因作用受体相关基因多态性

3.1.1ADORA1基 因ADORA1基 因 为 腺 苷 受体A1基因，位于染色体1q32.1上，长约39 kb，包含4个外显子。ADORA1基因编码的A1受体由326个氨基酸组成，在大脑中广泛表达，含量最高，主要分布于神经突触［17］。咖啡因通过拮抗大脑内A1 受体，减少腺苷对呼吸的抑制作用，提高呼吸中枢对高碳酸血症的敏感性，增加神经兴奋性和呼吸驱动［18］。ADORA1基因在人群中表达为高度多态性，在不同地区和民族中各基因型分布频率差异显著，rs10920568、rs16851030、rs12744240、rs9660662、rs3766560、rs3753472 等是ADORA1基因常见且研究较多的SNP 位点。Kumral 等［7］的一项前瞻性病例对照研究首次证明了ADORA1基因多态性和咖啡因疗效的相关性，在55 名AOP 患儿中，25名对咖啡因治疗无反应，在胎龄＞28周的早产儿中，对咖啡因治疗有反应的早产儿携带ADORA1rs16851030 位点CC 基 因 型，CT 和TT 基因型对咖啡因治疗无反应（P=0.002）。He等［19］的研究入选了14个ADORA1的SNP 位点，发现咖啡因疗效在rs10920568和rs12744240位点不同基因型中存在差异，携带rs10920568 位点G 突变基因和rs12744240 位点T 突变基因对咖啡因无反应（P＜0.05）。因此，咖啡因疗效与ADORA1基因不同位点的SNP相关。

3.1.2ADORA2A基因ADORA2A基因为腺苷受体A2a 基因，定位于染色体22q11.23 上，长约18 kb，包含6个外显子。ADORA2A基因编码的A2a 受体由412个氨基酸组成，在大脑中主要分布于含有高浓度多巴胺的区域，在嗅觉结节和背侧纹状体神经元也有高水平表达［20］。咖啡因作用于A2a受体，阻断γ‐氨基丁酸的释放，减少对低氧的抑制，增加呼吸输出［18］，同时能调节膈肌的神经活动而刺激膈肌收缩［21］。研究表明，咖啡因引起的焦虑反应和对睡眠、运动的影响受到ADORA2A基 因 多个 位 点SNP 的 影 响［22］。rs5751876 是ADORA2A中研究最多的常见SNP 位点，与其他SNP位点如rs2298383和rs3761422等处于高度连锁不平衡状态。此位点突变为同义突变，不影响氨基酸序列，但其突变可能改变A2a受体活性和数量表达［23］。Childs等［24］研究发现rs5751876位点的不同基因型对服用咖啡因后引起的焦虑反应有显著影响（P＜0.05），相比于T等位基因携带者，C等位基因携带者摄入咖啡因后更容易产生焦虑，对咖啡因的敏感度更高。Mokhtar等［14］研究表明，对咖啡因无反应的早产儿rs5751876 位点T 等位基因频率显著升高（P=0.019，OR=2.89，95%CI：1.17～7.13）。 Kumral 等［7］研究发现 rs5751876、rs35320474、rs3761422位点CT和TT基因型AOP患病风险显著增高。此外，He 等［19］的研究中发现rs34923252 位点A 突变基因携带者和rs5996696 位点C突变基因携带者对咖啡因反应优于未突变的纯合子基因型个体。

3.1.3ADORA2B、ADORA3基因ADORA2B基因为腺苷受体A2b 基因，定位于染色体17p12上，长约30 kb，包含6个外显子。ADORA2B基因编码的A2b受体由328个氨基酸组成，在全身都有表达，但表达程度普遍较低，在4种腺苷受体中对腺苷的亲和力最低［25］。ADORA3基因为腺苷受体A3基因，定位于染色体1p13.2上，长约80 kb，包含2个外显子，其编码的A3受体由318个氨基酸组成，在睾丸、大脑、肾脏和肺中高表达［26］。A2b和A3 受体的激活都与肺部炎症介质释放有关，拮抗A2b 和A3 受体可以减轻过敏原等诱导的肺部炎症和支气管痉挛，改善呼吸功能［27］。A2b 和A3 受体的抑制需要高浓度的咖啡因，而低浓度的咖啡因即可对A1 和A2a 受体产生拮抗作用，因此咖啡因治疗AOP主要通过拮抗A1和A2a受体［28］。目前尚未发现ADORA2B基因的多态性与咖啡因疗效的相关性，但在ADORA3基因中发现rs10776727 和rs2298191 位点的SNP 与咖啡因疗效有关［19］，携带rs10776727 位点A 突变基因和rs2298191 位点C 突变基因对咖啡因治疗无反应，其具体机制尚不明确，这些位点的SNP 对咖啡因疗效影响的相关机制还需进一步研究。

3.2 咖啡因代谢相关基因多态性

3.2.1CYP1A2基因CYP1A2基因 属 于细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶系基因家族，位于染色体15q24.1上，长约7.7 kb，包含7个外显子和6个内含子，表达细胞色素酶系中CYP1A2酶。咖啡因由肝脏中CYP1A2、CYP2E1 酶代谢，经去甲基作用生成副黄嘌呤、茶碱和可可碱，其中CYP1A2酶占到了代谢的90%，并负责84%副黄嘌呤、12%茶碱和4%可可碱的代谢［16］。已经报道的CYP1A2基因功能相关的SNP达40余种，其常见位 点 rs2069514、 rs35694136、 rs2069526 和rs762551等的SNP可以影响酶的活性，进而表现出个体咖啡因代谢水平的差异。如rs762551 位点AA基因型对CYP1A2酶具有更高的诱导性，因而对咖啡因的代谢速率更高［29］。此外，有研究表明，rs2472299 位点的SNP 与咖啡因摄入习惯相关［30］。He等［19］研究发现，在早产儿中，血浆咖啡因水平与CYP1A2基 因rs762551 和rs2472299 位点 的SNP无关。Gao 等［31］对早产儿咖啡因的药物代谢动力学进行了研究，并且分析了CYP1A2基因的多态性和咖啡因药物代谢的相关性，结果发现CYP1A2基因 多 态 性（rs2069514、 rs2069521、 rs2069526、rs2470890、rs35694136、rs3743484、rs56107638和rs762551）不影响咖啡因的药物代谢过程。

研究表明，CYP1A2 酶在新生儿期无显著表达，1～3 月龄时只有成人的10%～15%［32］。早产儿由于肝酶系统发育的不成熟，咖啡因基本不经过肝脏清除，因此CYP1A2基因的多态性不影响咖啡因在早产儿中的代谢，对咖啡因的疗效也没有显著的相关性。

3.2.2AHR基因AHR基因为芳香烃受体基因，位于染色体7p21.1上，长约47 kb，由11个外显子组成。AHR基因表达的芳香烃受体（arylhydrocarbon receptor，AHR）由848个氨基酸组成，作为1 种转录因子调节CYP1A1和CYP1A2基因的表达。AHR基因在胎盘、肺、胸腺、肾脏和肝脏中高度表达。全基因组关联研究已经确定AHR基因的SNP 与咖啡因摄入量相关［33］。如欧洲人种咖啡因摄入量在rs4410790 位点不同基因型中存在显著差异，同时此位点的SNP 已经被证明影响咖啡因的去甲基化代谢过程［34］。He等［19］与Guo等［35］研究发现AHR基因rs4410790 和rs1476080 位点SNP 与咖啡因疗效有关（P＜0.05）。如前所述，CYP1A2 酶在新生儿期基本不参与咖啡因的代谢，因此AHR基因可能不通过CYP1A2 酶的代谢途径来影响咖啡因疗效。然而，AHR 在支气管、细支气管和肺泡上皮细胞中高表达，参与呼吸功能的调节。AHR 缺乏会下调介导器官发育和细胞增殖的基因，上调增加炎症的基因，影响肺的发育。此外，AHR 信号通路在保护新生小鼠和胎儿肺微血管内皮细胞免受高氧损伤中发挥重要作用［36］。因此AHR 信号通路可能通过影响早产儿肺功能而间接影响咖啡因疗效。

3.3 与咖啡因作用相关的其他基因多态性

3.3.1PDE4D基因PDE4D基因属于磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）系基因家族，位于染色体5q11.2‐q12.1上，长约617 kb，包含39个外显子，编码PDE4D 酶。咖啡因是第1个被确定的PDE 抑制剂，可非选择性拮抗此酶，减少第二信使环磷酸腺苷的浓度，增加细胞内Ca2+的释放，拮抗γ‐氨基丁酸A型受体。现普遍认为生理浓度的咖啡因不发挥PDE 的抑制作用，因此与治疗AOP 的关系不大［28］。但有研究发现，咖啡因疗效与PDE4D基因rs10075508 位点多态性有关，携带TT基因型对咖啡因治疗无反应（P=0.032）［19］。此基因位点与咖啡因疗效的相关性需更大样本的研究进一步论证，对其机制也需进一步探究。

3.3.2ADA基因ADA基因为腺苷脱氨酶基因，位于染色体20q13.12 上，长约32 kb，包含12个外显子，编码腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）。人体内腺苷由ADA 脱氨生成肌酐而被清除。ADA可通过与腺苷受体A1、A2a、A2b结合而影响腺苷受体的可用性［37］。研究表明，ADA 活性受到ADA基因多态性的影响，如rs73598374 位点G到A的突变导致ADA的活性降低，在GA基因型个体中，ADA 活性下降20%～30%，而摄入咖啡因可以作为ADA基因多态性功能效应的调节剂进而影响ADA 的功能［38］。He 等［19］研究发现，咖啡因治疗AOP 的疗效在ADA基因rs521704 位点不同基因型中表现出了显著差异，CA和CC基因型对咖啡因反应较好（P＜0.05）。因此ADA基因多态性可能与咖啡因疗效相关，由于相关研究尚少，需要在更大样本、不同种群的研究中加以论证。

3.3.3CLOCK基因CLOCK基因为昼夜节律基因，位于染色体4q12，长约118 kb，由28个外显子组成，编码CLOCK 蛋白。CLOCK 蛋白由846个氨基酸组成，与芳香烃受体核转录蛋白样1形成异二聚体，控制内源性昼夜节律系统。CLOCK基因的常见SNP（次要等位基因频率≥1%）在非洲人中有406个，欧洲人中有271个，亚洲人中有278个，美洲大陆人中有277个［39］，这些SNP 的遗传变异引起生理变化，进而导致睡眠结构和对精神疾病的易感性改变。如rs1801260 位点的SNP 影响CLOCK基因mRNA 的表达、功能和稳定性，与昼夜节律紊乱相关，rs12649507位点G等位基因携带会增加睡眠障碍风险［40-41］。昼夜节律的调控在人体细胞内普遍存在，有研究表明昼夜节律与药物在组织的循环和分布有关，影响组织对药物的反应［42］。咖啡因通过拮抗腺苷受体而促进觉醒，干扰睡眠，并调节CLOCK基因的表达而影响昼夜节律［43］。Guo 等［35］的研究发现包括rs12649507 在内的18个CLOCK基因位点SNP与咖啡因疗效显著相关。因此昼夜节律可能对咖啡因的疗效起着关键作用。此外，与咖啡因代谢相关的AHR 同样是调节昼夜节律周期的关键因子，和CLOCK 昼夜节律信号通路相互作用［44］，共同对咖啡因的疗效产生影响，其机制还需进一步探索。

4 小结

AOP 这种与发育相关的疾病也具有遗传学因素，咖啡因是目前应用最广泛的治疗药物，其疗效受到遗传因素的影响，与多种基因SNP 密切相关，但具体机制尚未完全明确。目前国内外研究尚处于起步阶段，未来需对AOP 的易感基因进行探索，以及开展更为全面的影响咖啡因疗效相关基因多态性研究，以揭示AOP 发病和治疗的遗传学机制，对携带AOP 不同易感基因的早产儿进行干预，并优化咖啡因在早产儿中的应用，进一步提高治疗效果，改善早产儿预后。