虎杖苷对THP‐1细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制研究

王春美 祁文静 任艳娇 盛光耀

（郑州大学第一附属医院儿童医院，河南郑州 450052）

急性单核细胞白血病（acute monocytic leukemia，AML‐M5）是急性髓细胞白血病（acute myelogenous leukemia，AML）的一种亚型，约占儿童AML 的11.5%～27.5%，尽管化疗可使80%的患儿获得完全缓解［1］，但因其较高的复发率及治疗相关的病死率，5 年无病存活率仅为40%～50%［2］，显著低于其他亚型AML。因此积极探索新的治疗策略，提高其预后，具有重要的理论和现实意义。虎杖苷是从中药虎杖的干燥根茎中提取的单体，体外具有抗肿瘤作用。本课题组前期研究证实，虎杖苷可有效抑制AML‐M5细胞株THP‐1细胞增殖并诱导其凋亡［3］，但具体机制不明。PI3K/AKT/mTOR信号通路在白血病的发病中起重要作用，本研究进一步探讨虎杖苷是否通过该信号通路影响THP‐1的增殖及凋亡。

1 材料与方法

1.1 实验材料

THP‐1细胞株（上海碧云天生物技术研究所），虎杖苷（北京Solarbio 公司），RPMI 1640 培养基（美国Corning 公司），Gibco 胎牛血清（美国Invitrogen 公司），DMSO（上海索宝生物科技有限公司），兔抗人PI3K、兔抗人AKT、鼠抗人p‐AKT、鼠抗人mTOR、鼠抗人p‐mTOR、兔抗人p70 S6K、兔抗人p‐p70 S6K、鼠抗人GAPDH 抗体（美国Abcam公司），山羊抗兔IgG‐HRP、山羊抗鼠IgG‐HRP抗体及CCK‐8试剂盒（上海碧云天生物技术研究所），Annexin V‐FITC 凋亡检测试剂、细胞周期检测试剂盒（美国BD 公司）。虎杖苷溶解于DMSO 中，稀释至10 mmol/L，储存于4°C 冰箱中，实验过程中根据需要稀释至不同浓度。

1.2 细胞培养

THP‐1细胞使用含10%胎牛血清RPMI‐1640培养基（含0.05 mol/L 2‐巯基乙醇、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素），置于37℃、5%CO2培养箱中培养。将处于指数增殖期的细胞用于实验。

1.3 CCK‐8法检测细胞增殖

在96 孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔，约含有4 000个细胞）。加入不同浓度的虎杖苷（0、1.9、3.9、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μmol/L）处理，每组设置5个平行复孔；之后将培养板放在培养箱中继续培养24 h、48 h，向每孔加入10 μL CCK‐8 溶液，培养箱内孵育4 h，酶标仪检测450 nm 波长的吸光度值。细胞增殖活力（%） = ［（A-A空白）/A0-A空白］×100（A：孔内含有细胞、CCK‐8溶液和不同浓度虎杖苷溶液的吸光度值；A空白：孔内无细胞，但含有细胞培养基和CCK‐8 溶液的吸光度值；A0：孔内含有细胞、CCK‐8 溶液，但未施加虎杖苷溶液的吸光度值）。实验独立重复3次。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

将处于指数增殖期的细胞接种于6孔板中孵育过夜，设立空白对照组（细胞中未施加虎杖苷溶液处理）和虎杖苷处理组，每组设3个平行复孔，48 h 后收集细胞。用1 mL 预冷的PBS 重悬细胞，显微镜下调细胞密度为2×105/mL～5×105/mL，取195 μL 细胞悬液至干净无菌的试管中，并加入5 μL Annexin V‐FITC，暗室中孵育10 min；室温1 000 r/min 离心5 min，弃去上清液，重悬细胞于190 μL 的结合液中；加入5 μL 的PI 染色液，混匀后上流式细胞仪检测。实验独立重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞周期

细胞培养及分组同1.4 小节。离心收集空白对照组和虎杖苷处理48 h 的细胞，4℃预冷PBS 洗涤1 次，1 500 r/min 离心5 min，弃上清；加入4℃预冷的70%乙醇1 mL 固定过夜；次日1 500 r/min 离心5 min，弃去固定液，加入0.5 mL 的PBS 重悬细胞；依 次 加 入RNaseA （终 浓 度50 μg/mL）、500 μL PI（100 μg/mL），避光孵育30 min；使用流式细胞仪检测，CellQuest软件检测G0/G1、S和G2/M期的细胞。实验独立重复3次。

1.6 Western blot法检测相关蛋白的表达

细胞培养及分组同1.4 小节。离心收集空白对照组和虎杖苷处理48 h 的细胞，冰上静置30 min以充分裂解，12 000 r/min 离心5 min，迅速将上清（蛋白提取液）转移至预冷新EP管中，即为细胞总蛋白。Bradford 法测定蛋白浓度。蛋白样本经10%的SDS‐PAGE 电泳分离，半干转至PVDF 膜上，含5%脱脂奶粉的TBST 溶液4℃封闭过夜。一抗（PI3K、 AKT、 p‐AKT、 mTOR、 p‐mTOR、 p70 S6K、p‐p70 S6K、GAPDH 抗 体，p‐p70 S6K 按1∶500 稀释，PI3K、p‐AKT、p‐mTOR 按1∶1 000稀释，p70 S6K 按1∶2 000 稀释，AKT、mTOR、GAPDH 按1∶3 000 稀释）室温孵育2 h，TBST 溶液洗涤10 min×3 次，TBS 溶液洗涤10 min×1 次；相应的二抗（1∶3 000 稀释）室温孵育2 h，TBST溶液洗涤10 min×3 次，TBS 溶液洗涤10 min×1次，ECL发光液处理后暗室内曝光，胶片于室温下自然风干；扫描仪扫描结果保存，Image J 软件分析灰度值结果，蛋白表达水平以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值表示，实验独立重复3次。

1.7 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计学软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s） 表示，2 组间比较采 用两样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 虎杖苷对THP‐1细胞增殖的影响

用不同梯度浓度的虎杖苷（0、1.9、3.9、7.81、 15.63、 31.25、 62.5、 125、 250、 500、1 000、2 000 μmol/L）分别处理THP‐1 细胞24 h、48 h，结果显示：在48 h时，虎杖苷对THP‐1细胞增殖有抑制作用，其半数抑制浓度（median inhibitory concentration，IC50） 约 为1 800 μmol/L（图1）。因此选择1 800 μmol/L 的虎杖苷处理THP‐1细胞48 h用于后续实验。

图1 虎杖苷对THP‐1细胞增殖的影响

2.2 虎杖苷对THP‐1细胞凋亡的影响

细胞凋亡结果显示，1 800 μmol/L 的虎杖苷处理THP‐1 细胞48 h 后，细 胞 凋 亡率为11.68%±0.25%，显著高于空白对照组（6.20%±0.54%），差异有统计学意义（t=18.360，P＜0.001），见图2。

图2 虎杖苷对THP‐1细胞凋亡的影响 右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞，细胞凋亡结果为早期凋亡+晚期凋亡细胞总和。

2.3 虎杖苷对THP‐1细胞周期的影响

细胞周期结果显示，1 800 μmol/L 的虎杖苷处理THP‐1细胞48 h后，细胞出现G0/G1期至S期的阻滞，表现为G0/G1期的细胞比例较空白对照组明显上升（P＜0.001），S 期的细胞比例较空白对照组显著下降（P＜0.001），但G2/M 期的细胞比例在两组间差异无统计学意义（P=0.389），见表1、图3。

图3 虎杖苷对THP‐1细胞周期的影响

表1 虎杖苷对THP‐1细胞周期的影响 （ ±s，%）

表1 虎杖苷对THP‐1细胞周期的影响 （ ±s，%）

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2.4 虎杖苷对THP‐1 细胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信号通路中相关基因蛋白表达的影响

Western blot 结果显示，1 800 μmol/L 的虎杖苷处理THP‐1细胞48 h后，虎杖苷组PI3K、AKT、p‐AKT、mTOR、p‐mTOR、p70 S6K、p‐p70 S6K 蛋白表达均较空白对照组显著降低（P＜0.05），结果见表2、图4。

表2 虎杖苷对THP‐1细胞中相关蛋白表达的影响 （±s）

表2 虎杖苷对THP‐1细胞中相关蛋白表达的影响 （±s）

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图4 Western blot检测两组信号通路相关蛋白表达的电泳图

3 讨论

目前儿童AML‐M5的治疗手段主要是化疗和造血干细胞移植，化疗在AML‐M5治疗中仍处于基础地位，但化疗过程中可能出现骨髓抑制、因粒细胞减少或缺乏而发生各种严重感染，以及原发耐药而导致化疗无效等。近年来，采用传统中药等植物提取物治疗肿瘤引起了大家的广泛关注。目前植物来源的长春新碱、紫杉醇、依托泊苷、喜树碱等早已广泛应用于临床，从传统中药提取的抗肿瘤药物如姜黄素、黄连素、冬凌草甲素等也已被证实体外具有抗肿瘤作用。从植物中筛选提炼新型抗肿瘤药物，研究其抗肿瘤作用并探讨其机制，已成为肿瘤领域的研究热点之一。

虎杖苷是从虎杖的干燥根茎中提取的第4种单体，又名白藜芦醇苷，研究表明虎杖苷有多种生物学作用，如抗血小板聚集、抗休克、抗心肌缺血/再灌注损伤、肝脏保护、神经保护、肺脏保护、抗感染、免疫调节等作用［4-7］。近年研究发现，虎杖苷亦具有抗肿瘤作用［8-9］，但大都是关于实体瘤的，其对AML‐M5的研究相对较少，具体机制仍不清楚。

本研究首先使用不同浓度的虎杖苷处理THP‐1细胞，观察其对THP‐1 细胞增殖的影响。结果发现，在48 h 时虎杖苷可显著抑制THP‐1 细胞的增殖，IC50 浓度为1 800 μmol/L，和本课题组既往研究的IC50 浓度不完全一致［3］，考虑与细胞株和虎杖苷来源不同有关，既往实验细胞株和虎杖苷来源于上海中科院细胞库和美国Santa Cruz 公司，本次实验细胞株和虎杖苷来源于上海碧云天生物技术研究所和北京Solarbio 公司，但结果均提示虎杖苷可有效抑制THP‐1细胞的增殖。

使用1 800 μmol/L 浓度的虎杖苷处理THP‐1 细胞48 h 后，细胞的凋亡率显著升高，同时细胞周期出现G0/G1期至S 期的阻滞，G0/G1期的细胞比例明显上升，S期的细胞比例显著下降，提示虎杖苷可能是通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用的。

PI3K/AKT/mTOR 是细胞内重要的信号转导途径，参与调控细胞增殖、生长、分化、凋亡等多个环节，影响多种恶性肿瘤的发生、发展及转归，并且与肿瘤细胞的耐药相关［10-11］，针对该信号通路相关分子的靶向药物研究是近年研究的热点。既往研究表明，PI3K/AKT/mTOR 信号通路的异常活动在急性髓系白血病的发病中起重要作用［12-13］，对PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制剂的研究是近年研究的热点。本研究结果显示，使用1 800 μmol/L浓度的虎杖苷处理THP‐1 细胞48 h 后，PI3K、AKT、p‐AKT、mTOR、p‐mTOR、p70 S6K、p‐p70 S6K蛋白表达均显著降低，提示虎杖苷可有效抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路，可能是虎杖苷抑制THP‐1细胞增殖，并诱导细胞凋亡的重要机制。

综上，虎杖苷能够在体外抑制THP‐1细胞的增殖、阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡，其作用机制可能是通过调节PI3K/AKT/mTOR 信号通路而实现的。本研究进一步阐明了虎杖苷的抗肿瘤作用，为虎杖苷治疗AML‐M5 的临床应用提供了实验室依据。