m6A甲基化修饰在类风湿关节炎发生发展中的作用*

万磊，刘健，黄传兵，赵磊，孙广瀚，朱子衡，李舒，马熙檬，程静，胡赛赛，李方泽，陈莹莹

1 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

2 美国希望之城国家医学中心和贝克曼研究所癌症生物学系 美国加州 91010

类风湿关节炎的主要临床特征包括关节肿胀﹑发热﹑疼痛﹑功能障碍和变形，这些都会导致关节残疾和生活质量下降[1-2]。尽管我们对类风湿关节炎发病机制的认识有了很大的提高，但对类风湿关节炎发病机制的认识仍受疾病异质性的限制，靶向治疗仍不理想。表观遗传学的作用，特别是 RNA 修饰在关节炎中的作用引起极大的关注[3]。已经证明DNA和组蛋白的表观遗传修饰参与了类风湿关节炎的发病机制，但探讨是否涉及RNA中N6-甲基腺苷（m6A）的修饰研究较少[4]。参与m6A调节的酶主要包括m6A甲基转移酶（methyltransferase）﹑去甲基化酶（demethylase）﹑m6A结合蛋白（m6A-binding proteins）。它们对细胞生命的调控至关重要。对M6A甲基化机制的广泛研究表明[5]，与m6A相关的RNA水平的调控是复杂多样的。研究表明[6-7]，m6A修饰对于包括免疫应答在内的多种生物过程是必需的。并且有越来越多的证据表明，其失调与许多人类疾病有关。进一步研究m6A甲基化在类风湿关节炎中的作用机制，将对免疫性疾病的治疗产生深远的影响。

m6A甲基化修饰基因

1 甲基转移酶

m6A甲基化修饰在天然免疫应答和抗肿瘤免疫中起着不可或缺的作用。m6A甲基转移酶促进m6A对RNA的甲基化修饰。最早发现的m6A甲基转移酶是METTL3﹑METTL14和Wilms肿瘤1相关蛋白（WTAP）[8]。这些蛋白并不是各自孤立的，而是会形成复合物共同行使催化功能。METTL3是一种肿瘤抑制因子，因为它对m6A修饰具有上调作用。METTL3在一些肿瘤疾病中表达增加，并介导增殖﹑转移和癌细胞的集落形成[9]。METTL3在类风湿关节炎中的作用机制尚不清楚。在类风湿关节炎患者中METTL3的表达显著升高，METTL3通过NF-kB途径影响类风湿关节炎炎症因子的分泌[10]。因此，METTL3可能具有治疗免疫疾病的潜力。研究表明[11]，METTL14的缺失依赖于mTOR信号诱导的自噬。METTL3和METTL14这两种蛋白有关键的催化结构域，两者之间会形成杂络物。其中METTL3是具有催化活性的亚基，而METTL14会在底物识别上起到关键作用。WTAP是一种在哺乳动物中发现的m6A甲基转移酶复合物。WTAP在招募METTL3和METTL14起到十分重要的作用。WTAP表达降低时METTL3的RNA结合能力显著减弱。这表明WTAP调节m6A甲基转移酶复合物向mRNA靶的募集并影响其结合能力[12]。WTAP的功能没有甲基化活性，但它与METTL3和METTL14复合物相互作用，显著影响功能细胞m6A的沉积[13]。

2 去甲基化酶

m6A去甲基化酶是从RNA中去除m6A甲基化基团。最常见的去甲基化酶是肥胖相关蛋白（FTO）和烷基化修复同源蛋白5（ALKBH5）。

FTO被认为是一种调节肥胖的蛋白。 属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关。FTO的过度激活会增加食物摄入，从而导致肥胖。无论是在DNA还是RNA中，FTO蛋白都是一种十分重要的去甲基化酶。FTO去除m6A修饰并调节mRNA的稳定性，这最终导致各种类型的疾病发生。FTO对疾病免疫逃逸至关重要。FTO蛋白在核心结构域上与Alkb蛋白家族相似，但是C端独有的长loop与Alkb家族其他蛋白有所不同。正是这种特有的结构域使得FTO蛋白能够对发生甲基化的单链DNA或单链RNA进行去甲基化修饰。一旦FTO基因转录水平发生异常，会引起多种风湿免疫性疾病如类风湿关节炎等[14]。ALKBH5是另一种重要的去甲基化酶，能够对细胞核中的mRNA进行去甲基化修饰，在N端有丙氨酸富集区和独有的卷曲螺旋结构。在细胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修饰水平显著上升。ALKBH5缺失通过YTHDF2依赖的方式降低单核-巨噬细胞上炎症因子的表达[15]。m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5通过调节细胞迁移﹑侵袭和转移来抑制细胞增殖。如果通过FTO和ALKBH5减少滑膜细胞的增殖和迁移，则可以延迟类风湿关节炎炎症反应的发生。因此，m6A去甲基化酶FTO和ALKBN5有可能成为在类风湿关节炎治疗的靶点。

3 阅读蛋白

m6A修饰的mRNA行使特定的生物学功能需要一种特定的RNA结合蛋白，RNA结合蛋白通过与RNA中的m6A甲基化位点结合而发挥特定作用，其编码基因被称为阅读蛋白。阅读蛋白包括YTH结构域的蛋白﹑核不均一核糖蛋白以及真核起始因子（eIF）等。具有YTH结构域的蛋白包括YTHDC1-2和YTHDF1-3等[16]。这些阅读蛋白的功能主要包括特异性结合m6A甲基化区域，削弱与RNA结合蛋白同源结合以及改变RNA二级结构从而改变蛋白与RNA的互作。YTHDF1-3主要在胞浆中特异性识别m6A修饰的mRNA[17]。YTHDF1通过与起始因子相互作用增强mRNA翻译和蛋白质合成。YTHDF2通过选择性结合并募集m6A-修饰的mRNA至mRNA衰变位点。YTHDF3已被认为是第一个阅读蛋白。YTHDF3通过与其他因子相互作用增强RNA翻译[18]。YTHDC1-2的作用部位主要在细胞核内。eIF3蛋白能够与RNA 5’端UTR上发生m6A修饰的碱基相结合，从而促进mRNA的翻译[19]。

m6A甲基化修饰对类风湿关节炎的影响

类风湿关节炎 特征在于免疫细胞浸润﹑成纤维细胞样滑膜细胞过度增殖以及软骨和骨骼破坏。类风湿关节炎关键的病理变化是巨噬细胞样滑膜细胞产生促炎细胞因子，包括 IL-1﹑IL-6 和 TNF[20]。大量研究表明调节免疫细胞是治疗 类风湿关节炎 的关键靶点之一。m6A甲基化通过控制基因表达在各种生物过程中发挥重要作用。m6A甲基化修饰参与对类风湿关节炎疾病的过程。m6A甲基转移酶MetTL3通过调节细胞因子变化减轻类风湿关节炎炎症反应[21]。

研究发现[22]，在类风湿关节炎患者中，外周血中MetTL3的表达显著增加，但其他RNA m6A甲基转移酶没有明显的变化。通过LPS刺激可以上调巨噬细胞中的MetTL3来增加总m6A含量，并且MetTL3相关的m6A修饰与细胞因子IL-6和TNF-a相关。研究表明，在类风湿关节炎患者m6A调节的甲基转移酶﹑去甲基酶和阅读蛋白表达发生变化[23]。也有研究发现[24]， m6A甲基转移酶MetTL3通过激活NF-kB信号通路促进类风湿关节炎 FLs的炎症反应。

DNA异常甲基化可能参与了类风湿关节炎的发生发展，异常甲基化的基因可能成为类风湿关节炎评估发病﹑疾病进展和疾病严重程度的生物标记物或预测因子，也有望成为类风湿关节炎治疗的潜在靶点[25]。 研究发现[26]，METTL3 表达在人类风湿关节炎滑膜组织和大鼠 AIA 模型中显着上调。METTL3敲低抑制了人 类风湿关节炎-FLS 和大鼠 AIA-FLS中的白介素 （IL）-6﹑基质金属蛋白酶 （MMP）-3 和MMP-9 水平。相反，它们因 METTL3 过表达而增加。此外，在 FLS 中，METTL3 可能激活核因子 （NF）-κB信号通路。研究表明，METTL3可能通过NF-κB信号通路促进FLS激活和炎症反应。

通过c-Myc基因启动子甲基化在类风湿关节炎发病中的作用研究发现[27]，c-Myc基因低甲基化可能与类风湿关节炎的发病相关，且c-Myc（chr8:127736502）甲基化率与IL-17水平呈负相关。

类风湿关节炎患者中ALKBH5﹑FTO和YTHDF2表达显著变化[28]。YTHDF2 降低显着增加了 LPS 诱导 的 IL-6 ﹑TNF-α﹑IL-1 β 和 IL-12水 平 表 达。研究发现[29]，与对照组相比，类风湿关节炎 患者中ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 的 mRNA 表达显着降低。在接受常规治疗的类风湿关节炎患者中，ALKBH5的mRNA表达显着增加。 FTO 的 mRNA 表达与疾病活动性评分 28 （DAS28）﹑补体 3 （C3）﹑免疫球蛋白G （IgG） 和淋巴细胞与单核细胞比率 （LMR） 相关。YTHDF2 的 mRNA 表达与 RBC﹑L%﹑N%﹑NLR 和LMR 相关。逻辑回归分析显示，外周血中 ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 的表达降低是 类风湿关节炎 的危险因素。此外，与对照组相比，类风湿关节炎 患者外周血整体 m6A 含量显着增加，并且 m6A 含量增加与 FTO mRNA 表达降低呈负相关。研究说明了 ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 在 类风湿关节炎 中的关键作用，这为认识类风湿关节炎 的发病机制提供了新的见解，同时也是一种新型的类风湿关节炎 生物标志物。

类风湿关节炎DNA甲基化干预研究

刘喜德等[30]运用real time PCR﹑反义寡核苷酸技术﹑细胞培养﹑转染等方法进行体内及体外实验，基于miRNA-146a对类风湿关节炎患者DNA甲基化调控作用研究中药温化蠲痹方治疗活动期类风湿关节炎增效的分子机制。了解ras-MAPKs信号转导通路是否介导了miRNA-146a对DNA甲基化调控作用，研究温化蠲痹方对miRNA-146a调控DNA甲基化作用的影响，阐释其治疗类风湿关节炎增效的分子机制。研究发现中药温化蠲痹方具有下调类风湿关节炎患者外周血PBMC 微小RNA-146a表达，上调DNA甲基化转移酶表达，可能通过ras-MAPKs信号转导通路影响微小RNA-146a调控类风湿关节炎患者DNA甲基化作用而达到治疗类风湿关节炎目的。

刘焕兴等[31]通过观察甲氨蝶呤片（MTX）治疗类风湿关节炎对Th17细胞DNA甲基化的影响及其机制。结果显示，治疗后ESR﹑CRP及PLT水平显著降低（P＜0.05），Th17细胞比例及IL-17水平显著降低（P＜0.001），DNMT1基因mRNA表达水平显著升高（P＜0.001），ROR-γt基因mRNA表达水平显著降低（P＜0.001），ROR-γt基因甲基化比例显著增加（P＜0.05）;Th17细胞比例与IL-17水平呈正相关，ROR-γt基因甲基化程度与IL-17水平呈负相关（P＜0.05）。说明甲氨蝶呤可通过提高类风湿关节炎患者Th17细胞ROR-γt基因甲基化程度抑制体内IL-17分泌改善和延缓疾病进程，同时此过程有DNMT1酶参与。

刘亚飞等[32]利用风寒湿刺激类风湿关节炎动物模型，观察风寒湿因素刺激对关节炎的DNA甲基化水平影响。结果发现，与正常组相比，风寒湿病证结合模型组关节炎指数评分≥5分的比例显著升高。大鼠踝关节直径显著增加。与类风湿关节炎模型组相比，风寒湿病证结合模型组单个核细胞 DNA甲基化水平显著下降。单个核细胞组蛋白H3乙酰化水平有所升高，但无统计学意义。结论风寒湿因素可能通过下调单个核细胞DNA甲基化水平，从而影响类风湿关节炎严重程度。

John等[33]人通过对 早期类风湿性关节炎DNA 甲基化水平的测定，观察缓解疾病的抗风湿药（DMARD） 是否与调节DNA 甲基化水平有关。结果显示 DNA 甲基化与早期 类风湿关节炎 中改善疾病的抗风湿药物治疗反应有关。

综上所述，m6A甲基化修饰蛋白是否参与类风湿关节炎疾病的发生和发展全过程需进一步研究。m6A 甲基转移酶可以甲基化非编码 RNA。然而，关于非编码 RNA 与 m6A 在类风湿关节炎疾病中相互作用的研究很少。此外，m6A在T细胞稳态或其他免疫细胞分化中的作用研究偏少。同时，关于药物对m6A甲基化修饰蛋白的干预研究尤为不足。因此，需要进一步的研究来确定 m6A 在类风湿关节炎中的潜在作用靶点和分子机制。