基于TLR9/MyD88信号通路探讨针刺干预运动损伤炎症反应的研究进展*

周荣杰，高 明，王强梅，李 慧，李少雄

（上海中医药大学，上海 201203）

骨骼肌在长时间、超负荷的运动刺激下会不断产生新的生物适应性,从而使得力量性、协调性不断提高。正常、适度的运动一般不会对骨骼肌产生负面作用，但在竞技体育运动中，运动员为了提高个人竞技水平，不得不长期进行重复性、高强度训练，以保持良好的竞技状态。研究发现长时间、大强度或非习惯性离心运动会造成骨骼肌超微结构损伤（Exercise-induced muscle dam‐age,EIMD），出现不同程度的延迟性肌肉酸痛（Delayed onset muscle soreness,DOMS）[1,2]。虽然运动损伤可以通过及时的休息得以缓解，但如果组织休息不充分，或已超过了肌肉本身的代偿应激能力，则可能导致损伤不断叠加，深层发展，形成不同程度的炎性粘连、炎性纤维组织增生等病理性改变，最终引起不可逆的组织变性[3,4]。这也是目前很多运动员伤病反复发作一个重要因素，因此早期必要的干预和纠正就显得十分重要。运动损伤后首先会在局部触发炎性细胞和促炎因子浸润。炎症反应与骨骼肌修复重塑、DOMS、线粒体自噬凋亡等均关系密切，但持续、过度的炎症反应也会加剧组织损伤。目前对于运动损伤后促炎因子发生机制仍缺乏全面认识。TLR9/MyD88 作为介导机体各类细胞损伤后炎症反应的一个重要信号转导通路，与很多炎性因子表达都有直接和间接关系,且通常都以mtDNA 作为配体激活[5]。骨骼肌在损伤过程中，泄露的线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）可能会被TLR9 捕获，通过髓样分化因子88(myeloid differ‐entiation factor 88,MyD88)激活下游信号途径，增加白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎细胞因子的表达[6]。

针灸作为传统医学一种操作简便的外治法，临床上展现出良好的抗炎镇痛效果，在干预运动损伤的疗效明显优于其他疗法。但针刺究竟如何抑制运动损伤后一系列炎症反应，能否将TLR9/MyD88信号通路作为针刺干预和纠正骨骼肌损伤后过度炎症反应的新靶点，仍需要进一步研究。本文就综合目前国内外相关领域研究成果，探究针刺对TLR9/MyD88 信号通路的影响，以期针刺在治疗运动损伤炎症反应的临床应用提供一定的理论参考。

1 炎症反应对运动性损伤的影响

运动性损伤后，炎症反应是必然发生的过程，参与骨骼肌损伤修复的病理进程。甚至在运动结束后即刻便检测到骨骼肌中TNF-α 和IL-6表达明显上升，并且能够维持较长时间[7]。但炎症反应也是一把“双刃剑”。从传统意义上讲，骨骼肌损伤后早期出现的炎性因子具有吞噬、清除作用，为组织修复、再生创造适宜环境；但通常炎症反应期较长，机体可能通过增加局部bFGF 蛋白浓度来促进成纤维细胞增殖，使结缔组织增生形成细小疤痕组织来修补损伤区域，则会导致肌肉收缩性下降，增加运动再损概率[8,9]。因此对于轻、中度骨骼肌损伤，持续过度的炎症反应缺乏必要性。

1.1 炎症反应的正性作用

炎性细胞因子被认为在肌肉修复再生中发挥关键性作用[10]。急性高强度运动后，局部出现肿胀、充血，甚至肌组织坏死、降解，随后中性粒细胞、巨噬细胞及大量炎性因子的浸润。骨骼肌具备强大的再生能力，轻、中度损伤经过一系列清除、修复、重塑等过程，能够最大程度恢复到其本身的结构功能。在这个过程中，损伤局部浸润的炎症细胞和促炎因子便发挥着极其重要的作用：一方面炎性细胞能够吞噬坏死的肌肉组织和损伤的细胞碎片，为组织再生创造良好的环境；另一方面炎症反应过程中所分泌生长因子通过激活静息状态下的肌卫星细胞，使其增殖形成新的肌管细胞，进而发育成肌纤维修复损伤的肌纤维，完成肌肉的再生过程[11,12]。

大部分炎性细胞因子存在网络型的结构作用机制，但彼此在功能也能单独发挥效应。比如IL-6 具有强烈促炎作用，在运动后EIMD 损伤修复、DOMS 等许多方面均发挥重要作用[13]；TNF-α作为损伤早期表达的促炎细胞因子，在启动抗炎反应过程发挥至关重要的作用，通过刺激血管内皮细胞表达粘附因子，刺激单核吞噬细胞和嗜中性粒细胞趋化作用，引起白细胞在炎症部位聚集，是目前炎症反应最重要的指标之一[14]；L-1β作为IL-1 的一种存在形式，又称淋巴细胞刺激因子，可以促进炎症、对抗入侵的病菌等，具有免疫调节功能[15]。

1.2 炎症反应的负性作用

DOMS 一直是影响运动员训练和比赛的重要因素之一。近年来对DOMS 形成机制一直存有争议，目前普遍认为DOMS 形成与离心收缩诱导的肌肉损伤和炎症反应有关[16]。研究者通过让受试者作肘曲离心收缩运动,发现口服非固醇类抗炎性药物的受试者运动后的肌肉酸痛感较对照组轻的多，提示急性运动损伤炎症反应与DOMS的发生存在关系[17]。另一组人体实验也证实，在对参与离心运动的志愿者服用坚果混合饮料后，检测体内炎症因子表达明显降低，与对照组相比炎症水平高低与DOMS 症状轻重存在正相关[18]。

此外，部分炎症反应分泌物可以引起局部毛细血管扩张，血管通透性增强，加速炎性物质渗出[19]。由于血管扩张、组织液渗出使得肌肉充血水肿，进一步会加剧组织损伤程度。研究还发现部分炎性因子，如IL-1β 能够与游离感觉神经元响应受体结合，引发痛觉过敏，产生痛感[20]。在一项通过高强度运动来造成小鼠运动损伤模型的实验研究中，发现毛细血管生成素发挥其抗炎和抗氧化作用能明显减轻运动诱导的肌肉损伤[21]，并且之后研究还发现毛细血管生成素还是通过抑制上游MyD88 及下游N F-κB 信号级联发挥其抗炎、抗痛觉过敏作用[22]。这说明可以通过减轻炎症反应来达到保护肌肉组织的目的，也反过来证实炎症反应可以引起肌肉组织损伤加剧。

2 TLR9/MyD88信号通路

Toll 样受体（Toll-like receptors,TLR）家族属于一类表面模式识别受体，在固有免疫系统中发挥重要作用，以抵抗外来病原微生物的入侵，维持机体自身内环境的稳态。TLR9 属于Toll 家族目前已发现的10位成员之一，其表达于胞内细胞器，如内体和吞噬溶酶体。TLR9 是第一个被证明能够感知核酸的TLR 受体，它可以识别内溶酶体室DNA 中低甲基化的CpG 基序，进而触发MyD88依赖或非依赖的信号转导途径，释放促炎症细胞因子和诱导Ⅰ型干扰素活化[23]。

MyD88 依赖性信号通路存在多条转导途径。MyD88 作为TLR 家族介导的先天免疫反应的关键性接头蛋白，当机体遭遇细菌、病毒、真菌感染等外源性侵害时，损伤的线粒体会泄露mtDNA，通过TLR9 激活巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞，并招募MyD88，促进这些免疫细胞的p38 促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）磷酸化，使机体产生特异性抗体，来抵御病原微生物的入侵[24]。同时机体一些自身应激损伤也会导致线粒体释放出mtDNA 与TLR9 结合，TLR9 会迅速募集MyD88，激活下游核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号途径，诱导TNF-α、IL-6 和IL-1β 等促炎性细胞因子的表达。如在急性心肌梗死导致的无菌性炎症中，mtDNA 通过TLR9 激活和NF-κB 触发固有免疫反应，加重了心肌组织的损伤[25]。此外，mtD‐NA 还以可通过激活TLR9 招募MyD88 诱发干扰素调节因子7（interferon regulation factor 7,IRF7）释放。研究表明IRF7 可以诱导使树突状细胞和其它免疫细胞产生I 型干扰素（type I interferon,IFN-I）介导炎症反应[26]。

3 针刺干预TR9/MyD88 信号通路对运动损伤炎症反应的影响

骨骼肌属于一种张力复合体，通过以肌束膜为中心的横纵向机械通路进行传导。反复、超载的离心运动会对骨骼肌横向张力传递产生不利影响，诱发局部炎症反应，引起骨骼肌纤维化，破坏肌组织本身的生物力学稳态。研究发现TR9/MyD88信号通路通路的异常激活，会进一步导致骨骼肌纤维化[27]，而骨骼肌纤维化则是肌肉质量和力量降低的重要因素。针刺是在特定穴位操作，可以将局部刺激信号通过组织间机械力的传导传递给肌膜、肌细胞，引发胞内微观结构功能的改变[28]。目前来看针刺通过抑制TLR9 相关信号通路来干预骨骼肌运动损伤仍需进一步探究。

3.1 针刺对骨骼肌mtDNA泄露的影响

线粒体是细胞能量代谢的场所，是调控机体的生命活动所必要细胞器。长时间、超负荷的运动刺激下，无论是机械应力还是氧化应激，均会对骨骼肌线粒体造成不同程度程度的损伤，在电镜下会观察到大量的线粒体积聚到肌膜下，同时伴有肿胀、空泡化，膜结构模糊、不完整甚至消失等超微结构异常变化[29,30]，这种损伤必然会对mtDNA 产生不利影响。有文献报道急性长时间运动或重复高强间歇运动后可以检测到骨骼肌细胞mtDNA 降低[31]。李省天等[32]发现急性高强度运动小鼠血清游离的mtDNA 显著升高，但对于血清中游离mtDNA 是否全全部来源于骨骼肌尚需考证。

以上研究表明高强度运动造成的骨骼肌线粒体损伤，会引起部分mtDNA 泄露。mtDNA 泄露途径目前认为mtDNA 片段能通过位于线粒体内外膜上的线粒体膜通透性转换孔（mitochondri‐al permeability transition pore,mPTP）进入胞浆[33]。目前通过激光共聚焦显微镜来观察mPTP，发现针刺预处理对mPTP 开放程度具有显著抑制效应[34]。力竭运动会引起mPTP 通透性高度开放，膜电位降低，增加线粒体损伤[35]，是因为线粒体本身既是氧化剂的主要来源，也是氧化剂破坏作用的靶点，运动状态下活性氧类（reactive oxygen species,ROS）产生增加，造成线粒体膜电位降低，mtDNA 产生增加，被泄露到胞质及细胞外[36]。电针预处理可以明显减少ROS 的产生，同时提高线粒体膜电位水平，降低氧化应激对膜电位的耗损[37,38]，从而维持线粒体内环境的稳态，可能在一定程度抑制了mtDNA的泄露。

3.2 针刺对mtDNA 介导的TLR9/MyD88 信号通路的影响

mtDNA 与细菌DNA 的CpG 同源，其甲基化修饰程度普遍较低[39]，结构的相似使其更容易被TLR9 受体所捕获。有文献报道大强度运动导致的肌肉损伤，mtDNA 可以通过TLR4/TLR9 信号通路来激活机体的炎症反应[40]。这种炎症反应既可以是局部的，也可以是整体的。比如在急性心梗导致的无菌性炎症中，进入循环中的mtDNA增加，通过结合TLR9 受体，激活NF-κB，诱导了心肌细胞损伤[41]。同理在运动损伤引起的mtD‐NA 泄露，一旦被TLR9 识别后，就通过MyD88 依赖型转导途径，激活下游NF-κB 信号通路，调节促炎性细胞因子的表达。

目前针对mtDNA 介导的TLR9/MyD88 炎症信号通路在运动损伤的临床和实验研究中较少，但通过增加mtDNA 的清除或对TLR9 通路进行靶向拮抗，来阻断下游的炎症因子效应在其他炎症相关疾病已有较多研究。针刺并不具有药物靶向性作用，而是通过整体性调节来下调炎性反应中病变部位的TLR 受体的表达，对TLR9、TLR2、TLR4等基因均抑制作用，来达到减轻炎症反应的目的[42]。杨长江[43]在研究脊髓TLR9 在大鼠胫骨癌痛中的作用中发现:电针能显著性降低胫骨炎症痛大鼠脊髓内TLR9的表达,提高其机械性痛阈,而对其非炎症型疼痛无此作用。提示针刺对TLR9 通路的有效抑制是干预运动损伤炎症反应的关键。

3.3 针刺对运动性损伤炎症因子的作用

炎性因子在运动性骨骼肌损伤过程中起着十分重要的调节作用。骨骼肌损伤后可以检测到多种炎性因子表达，如IL-1β、IL-10、IL-6、TNFα 等。即使在骨骼肌纤维结构无明显破坏，也无显著炎性细胞浸润得情况下，也可以检测到TNFα、IL-6 和IL-1β 显著升高[44]。这也说明炎症因子并非全部来自炎性细胞分泌，也可以产自其他途径。TLR9/MyD88信号通路本身是可以通过多途径对TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性因子表达进行调节，进一步佐证TLR9/MyD88 也可能是介导骨骼肌损伤后的炎症反应的信号通路之一。

针刺可以抑制运动后促炎因子释放，改善炎症反应。在运动后同时进行针刺干预能够降低促炎因子的峰值量，而且这种抑制作用是局部的，并不会对非针刺部位或血液产生影响[45]。但也有研究认为离心运动后进行针刺干预可以增加针刺部位骨骼肌促炎因子表达量，但会促使其到达峰值之后快速消退[46]。这可能与所选择炎性因子指标差异或穴位配伍不同有关。但总体而言，针刺对运动损伤后炎症反应都有明显缓解作用，在临床上往往都能获取一个较为满意疗效。

4 小结与展望

内源性mtDNA 配体诱导的TLR9/MyD88 信号通路，不仅可以引起组织炎症，甚至还能够直接导致细胞损伤。运动损伤在竞技体育中日益频发，目前研究也已证实持续炎症反应是引起组织损伤加剧的一个重要因素，但炎性细胞因子在骨骼肌损伤的各阶段也发挥不同作用。线粒体损伤作为骨骼肌损伤一个重要方面，尤其是大负荷运动对骨骼肌线粒体在形态结构和功能上均会造成不同程度的损伤。线粒体损伤会导致部分mtDNA 通过各种途径被泄露到胞质或细胞间质中。低甲基化修饰的mtDNA 又很容易被TLR9所识别，从而通过下游信号转导，调节IL-6、TNF-α、和IL-1β 等促炎因子释放。此外，TLR9/MyD88炎症信号通路，还可以促进中性粒细胞聚集和巨噬细胞的活化，扩大炎症反应。这些促炎因子和炎性细胞在骨骼肌损伤炎症反应过程中均参与其中。

一直以来，针刺在治疗运动损伤应用较为广泛，但对其抗炎机制始终难以用现代生物学理论加以全面阐释。有学者提出针灸是否是通过迷走神经、乙酰胆碱及受体所构成的胆碱能抗炎通路来发挥其抗炎调节作用[47]。实际上针刺调理机制较为复杂，并非单一通路可以解释清楚。此外，骨骼肌损伤炎症因子调控机制也极其复杂，除了炎性细胞通路，骨骼肌本身也可以分较多炎性因子。针刺对TLR9/MyD88 信号通路干预也只能阐述其部分机理，想要进一步揭示针刺对运动损伤炎症效应机制的作用还需要更多的研究。