LC-MS/MS检测尿液类固醇激素在疾病研究中的应用

张潇莉，杨娜，葛佳佳，朱怀军，何骏，葛卫红，*（.南京中医药大学中西医结合鼓楼临床医学院，南京 0008；.南京大学医学院附属鼓楼医院药学部，南京 0008）

类固醇激素是一类由胆固醇经一系列酶催化代谢产生的脂溶性小分子化合物，主要包括性激素和皮质激素。内源性类固醇激素的变化在内分泌疾病及相关代谢性疾病的筛查与诊断中具有重要参考价值，其精确定量分析对于临床研究是十分必要的。目前，临床常用检测类固醇激素的方法主要是免疫分析法，但随着液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术的不断发展，其因高通量、高灵敏度和高特异性，适用范围广、检测周期短，并且具有同时定性定量分析多种激素的优势，已逐渐替代免疫分析方法，成为临床检测与疾病筛查及诊断中重要的新技术。

与血清、血浆样本相比，尿液样本可以被非侵入性地连续收集，患者更易接受，且尿液前处理相对简单。尿液排泄作为人体排泄的重要途径，尿液中涵盖大量内源性极性代谢产物。通过对尿液样本进行定量，可提供一个较为完整的代谢概况。例如，24 h尿儿茶酚胺的结果可比血儿茶酚胺更加精准地反映交感神经和肾上腺髓质的功能。临床诊断库欣综合征时，24 h尿游离皮质醇能够避免皮质醇的瞬时变化，避免血中皮质醇结合球蛋白浓度改变而影响皮质醇测定结果，且在大剂量地塞米松抑制试验中24 h尿游离皮质醇对库欣综合征诊断的灵敏度和特异性都高于血皮质醇。5-羟吲哚乙酸的定量检测可用于神经内分泌肿瘤患者的监测和诊断，虽然其可以在血样中被定量分析，但临床通常采用尿液样本进行检测。因此，利用LC-MS/MS技术检测尿液样本中的内源性物质具有一定优势，且已成为临床检测的一个重要方向。本文主要就LC-MS/MS技术在尿液类固醇激素测定中的研究及临床应用进行综述。

1 基于LC-MS/MS技术的尿液类固醇激素定量方法的研究现状

LC-MS/MS技术是一种结合液相色谱与质谱的定性和定量的分析技术。该技术具有液相色谱的高效分离性能和串联质谱的高灵敏度、高特异性检测的特点，可实现多种成分的同时测定，适用于血清、尿液等复杂生物样本的分析检测。目前，利用LC-MS/MS技术在尿液中检测内源性类固醇激素正在迅速发展，其前处理不断优化，灵敏度不断提高，检测数量也逐渐增多。

尿液中涵盖大量的内源性极性代谢产物，在分析检测前通常需要进行前处理以去除干扰性小分子。常用的前处理方法主要有蛋白质沉淀法、液液萃取法和固相萃取法，但上述方法均存在操作时间长，处理步骤复杂等缺点。随着尿液前处理方法的不断优化，出现并行样品处理、柱交换和在线固相萃取等技术。这些技术可提高检测灵敏度，增加检测种类，缩短处理时间，提高效率且不影响检测质量，已在生物分析应用中获得认可。例如Naldi等开发并验证了一种基于全自动的在线固相萃取进行样品提取和定量的LCMS/MS法，能同时检测尿液和水样中多种类固醇激素，分离分析只需10 min，节省大量时间并减少流程错误。Son等建立了一种新的LC-MS/MS方法，使用

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-葡萄糖醛酸苷酶和固相萃取进行处理并提取，可用于检测和分析尿液中的39种类固醇激素。

新色谱技术的应用促进了LC-MS/MS技术检测类固醇激素的发展，例如超高效液相色谱法（UPLC）、整体色谱法及亲水相互作用色谱法等，不仅能提供更高的灵敏度和分离效率，运行时间缩短，同时能最大限度地减少基质效应。传统色谱柱采用3 μm或5 μm的颗粒进行填充，而超高效液相色谱法的引入使高效小颗粒色谱柱应用于检测，其通常填充＜2 μm的颗粒。与传统色谱柱相比，高效小颗粒色谱柱能提供更高的稳定性，减少溶剂使用量，增加灵敏度。如Zhou等采用UPLC-ESI-MS法同时检测尿液样本中14种类固醇激素，该方法经过全面验证，各激素提取回收率均大于87%，灵敏度更高。Dmitrieva等利用UPLC-HRMS技术检测9种尿类固醇激素，采用分散液液微萃取法提取，该方法容易操作且不需大量有毒有机溶剂。

质谱电离技术的发展可以提高LC-MS/MS技校检测的特异性、灵敏度和稳定性。其中大气压光化学电离技术作为大气压化学电离、电喷雾电离技术的补充，是更具有选择性，在类固醇激素分析中展现出优势，能减少基质效应、提高灵敏度，但电喷雾电离技术在检测尿类固醇激素方面的应用更广泛，其与三重四极杆仪相结合测定类固醇激素有着更高的灵敏度与特异性，且化学衍生化可以提高类固醇激素的电离效率，提高灵敏度，并有助于适合的监测模式。如Berg等开发建立的LC-ESI-MS/MS法可检测尿液中27种雌激素相关代谢物，该方法经过验证，定量检测灵敏度可达到pg级。Dai等建立了新的LCESI-MS/MS法，使用氘4-（二甲氨基）-苯甲酸衍生化试剂，提高电离效率与检测灵敏度，能检测到24种尿类固醇激素。

综上，样品前处理的优化，色谱条件的发展，灵敏准确的质谱仪都在加快LC-MS/MS技术的发展，也使尿液类固醇激素的检测有了更大的进步。这些应用均表明LC-MS/MS技术具有准确可靠的多分析物分析的潜力。

2 尿液类固醇激素检测的临床应用及研究进展

2.1 皮质激素

皮质激素来源于肾上腺皮质，包括糖皮质激素和盐皮质激素，其在许多生理过程中起到至关重要的作用。皮质激素代谢的改变是引起盐皮质激素过多综合征、先天性肾上腺皮质增生症和肾上腺功能不全的原因。研究发现，库欣综合征、多囊卵巢综合征、甲状腺功能亢进、妊娠高血压、先兆子痫及抑郁症等疾病也与体内这种改变有关。

先天性肾上腺皮质增生症是一种常染色体隐性疾病，体内21羟化酶缺乏会导致皮质醇和醛固酮合成受阻，两者体内代谢的改变引起疾病的发生。利用LC-MS/MS法对尿液中的皮质醇及其代谢物进行定量分析，可有效降低诊断假阳性率，提高筛查诊断准确性。如Pussard 等建立的LC-MS/MS法成功检测尿液中内源性皮质醇、雄激素及17-羟孕酮等，其结果可用于诊断先天性肾上腺皮质增生症，并能应用于患者激素替代治疗的定期监测。Kosicka等利用新建立的LC-MS/MS法对尿皮质醇和可的松及其代谢物进行定量，该方法经过充分验证，符合欧洲药品管理局的要求，可用于先天性肾上腺皮质增生症、库欣综合征等临床样本的分析。

人体内缺乏11

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-羟基类固醇脱氢酶，无法将皮质醇转化为皮质酮，导致皮质醇在体内蓄积而引起库欣综合征。24 h尿游离皮质醇是皮质醇综合分泌的指标，也是库欣综合征的合理筛查标志物。灵敏准确的LC-MS/MS法检测尿游离皮质醇对于库欣综合征的筛查诊断十分有利。最近的一项研究发现，通过LC-MS/MS法测定的24 h尿游离皮质醇在临床实践中具有优越的诊断性能，其准确度与内分泌学会指南建议的诊断方法的准确度相同，这表明测定24 h尿游离皮质醇能够更加方便准确地鉴别库欣综合征。例如，Ceccato等建立了标准化的LC-MS/MS分析方法测定尿液中游离皮质醇的浓度，并评估该方法用于诊断库欣综合征的灵敏度及特异性，通过实验得到了库欣综合征患者不同发病阶段的皮质醇水平参考范围，该范围为库欣综合征的对症治疗提供了一些参考。LC-MS/MS法可以避免免疫分析法检测皮质醇时的干扰问题。LC-MS/MS法在尿液中检测皮质醇的假阴性率较免疫分析法低，能更加方便、快速地获得结果。Bianchi等利用LC-MS/MS法检测库欣综合征患者的尿液样本，其皮质醇检测结果能满足临床医师对患者实验室数据的要求，且准确度更高。因此，利用LC-MS/MS法检测尿液皮质激素在体内水平的变化，对库欣综合征的筛查与诊断十分有利。慢性压力和重度抑郁症与皮质醇代谢有关，为了更好地了解抑郁症，Zhai等利用LC-MS/MS法定量分析健康成人和抑郁症患者尿液中的5种皮质激素（皮质醇、可的松、四氢皮质醇、异源四氢皮质醇和四氢可的松），结果表明糖皮质激素水平在抑郁症患者中产生了显著变化，并发现了患者体内11

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-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ型活性降低，5

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-还原酶途径出现功能障碍。体内皮质醇代谢的变化以及酶活性的改变为寻找抑郁症的潜在病因提供了新的想法。多囊卵巢综合征与雄激素和皮质醇代谢物排泄增强以及5

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-还原酶活性增加有关，皮质激素生成增多是其重要的致病途径。Cuzzola等基于新开发的LC-MS/MS法测定多囊卵巢综合征患者的游离总糖皮质激素，激素定量分析结果可用于支持与皮质醇代谢相关病理的临床诊断。

上述疾病均可以通过监测皮质醇、可的松及相关代谢物在体内的水平变化来筛查诊断，因此利用灵敏、准确、高效的LC-MS/MS法用于检测尿液皮质激素水平变化，对先天性肾上腺皮质增生症、库欣综合征等疾病进行方便筛查、及早诊断与治疗十分重要。

2.2 性激素

2.2.1 雌激素 雌激素是体内常见的甾体类固醇激素，包括雌酮、雌二醇、雌三醇等，主要由卵巢产生，也可由雄激素经芳香化转化产生。雌激素具有广泛而重要的生理作用，不仅作用于女性生殖系统，而且对内分泌、心血管、中枢神经系统、骨骼、皮肤及附属物等均有明显的影响。内源性雌激素的定量分析在多种疾病的诊断治疗中至关重要，包括女性生殖器模糊、多囊卵巢综合征、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌等。最近的研究发现雌激素及代谢物在女性盆底功能障碍性疾病，中枢神经系统疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病），骨质疏松等骨骼疾病以及糖尿病等疾病病因解释中起到很大作用。

考虑到儿童和老年人体内雌激素浓度较低，临床诊断和流行病学研究都需要高灵敏度和高特异性的方法，且检测样本应具有方便采集、非侵入性特点，为此研究者们进行了一系列研究。例如，Coburn等利用LC-MS/MS法检测血清、血浆和尿液中雌激素水平，该研究发现血清和尿液中雌激素及其代谢物测定值之间具有一致性，且单个代谢物的尿液浓度与血清浓度相关，并证明了尿液和血清中雌激素图谱的一致性，结果证实尿液是流行病学研究中的一种适合替代物。Faupel等对比了LC-MS/MS法、放射性免疫分析法和酶相关免疫吸附剂检测法测定尿液中雌激素及代谢物水平，其结果表明LC-MS/MS法更适合于测定绝经后女性的雌激素及代谢物绝对或相对数量或水平变化，还能更全面地了解雌激素代谢物的特征。综上，与血清相比，尿液中雌激素的浓度相对较高，并且其采集是无创性的，参与研究者更容易接受。因此，选择尿液样品测定雌激素及其代谢物具有明显优势。

对雌激素及其代谢物进行定量分析对于阐明其致癌机制以及在子宫内膜癌和乳腺癌的早期诊断、筛查、预防和治疗领域的进一步应用具有重要意义。例如，Zhao等利用LC-MS/MS法检测子宫内膜癌患者与健康女性尿液中7种内源性雌激素代谢物（2-羟基雌二醇、2-羟基雌酮、4-羟基雌二醇、4-羟基雌酮、16

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-羟基雌二酮、2-甲氧基雌二醇和2-甲氧基雌酮），发现与健康女性相比，子宫内膜癌患者体内4-羟基雌二醇增多，2-甲氧基雌酮和2-甲氧基雌二醇减少，其中4-羟基雌二醇在体内的高表达可能成为子宫内膜癌高危人群的筛查指标。这为子宫内膜癌患者尿液生物标志物的发现提供了独特的见解，为子宫内膜癌的早期筛查提供了新的方法，该结果还需要广大研究者进一步研究确认。

乳腺癌患者体内雌激素代谢物同样失衡。Berg等建立了一种新的LC-MS/MS法在极少量尿液中检测27种雌激素及其代谢物，对该方法进行充分验证后用于检测乳腺癌患者的尿雌激素及代谢物浓度。结果表明内源性雌激素代谢的不平衡与乳腺癌发展风险增加有关，这为临床寻找评估乳腺癌风险的潜在生物标志物，尽快实现早期发现和治疗乳腺癌提供了新的思路。这些研究对于加快LC-MS/MS法应用于临床检测提供了更加令人信服的证据。阐明雌激素及其代谢物在体内的变化特征对于上述疾病的临床研究与诊断十分关键，因此，利用准确特异的LC-MS/MS法来评估体内雌激素及代谢物浓度有利于及早发现各种疾病，进而进行积极有效的临床干预。

2.2.2 雄激素 雄激素又称为男性激素，包括睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮等，主要是由睾丸合成和分泌，肾上腺和卵巢也分泌少量。其主要功能为促进男性性器官与精子发育成熟，促进蛋白质合成，加快骨骼肌生长，抑制体内脂肪增加等。人体内雄激素代谢紊乱会引起肥胖、代谢综合征、2型糖尿病和骨质疏松，也会增加心血管、脑血管（如中风和短暂性缺血发作）和动脉粥样硬化等疾病的风险。监测尿液雄激素代谢物水平变化对于研究激素替代疗法对骨质疏松症和性腺功能减退的影响以及前列腺癌等癌症早期预后的潜在生物标志物十分重要。

人体内5

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-还原酶可催化睾酮转化为二氢睾酮，当二氢睾酮在前列腺和皮肤内积累到一定程度，会引起许多病理改变，如前列腺增生症、痤疮、女性多毛、男性脱发等。进一步明确雄激素水平变化与不同疾病之间的关系，有助于及早预防并对症治疗。例如，Im等通过监测尿液内源性雄激素浓度研究非那雄胺治疗脱发的疗效，其开发建立一种高灵敏度高特异性的LCMS/MS法，同时定量分析尿雄激素和前列腺素，并测定男性脱发组和正常对照组患者尿液中两种激素的浓度差异，从而分析该药物的治疗效果。该定量分析方法在雄激素代谢相关的炎症疾病中的应用也具有巨大潜力。

精确检测内源性雄激素有助于我们进一步了解并更好地治疗代谢紊乱。对此，Wang等开发了同时量化尿液中15种类固醇激素葡萄糖醛酸苷的LC-MS/MS法，结果发现尿液中脱氢表雄酮排泄增加后，患者开始出现肾上腺功能亢进症状（如多毛、脱发、痤疮、高血压等），这一发现为肾上腺功能亢进的早期鉴别诊断提供了新的思路，加快了临床尿液样本检测雄激素及其代谢物的进展，也为肾上腺功能亢进与多囊卵巢综合征区分鉴别提供了思路。多囊卵巢综合征患者体内睾酮和孕酮增多，产生与肾上腺功能亢进相似症状，仅通过临床症状无法准确鉴别，因此对疑似人群进行内源性雄激素和孕激素定量检测，有助于该疾病的鉴别诊断。利用LC-MS/MS技术对多囊卵巢综合征患者尿液中睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮等雄激素进行定量能将多囊卵巢综合征与其他疾病区分开，提高诊断准确性。

有研究表明，类固醇激素如硫酸和葡萄糖醛酸的结合形式，在尿液中的浓度要比血浆或血清中的更高。内源性雄激素硫酸和葡萄糖醛酸结合物可作为控制兴奋剂滥用的指标。因此，Strahm等开发了一种快速灵敏的LC-MS/MS法，用于同时分离和量化尿睾酮、还原胆烷醇酮及脱氢表雄酮等的硫酸和葡萄糖醛酸结合物，该方法适用于检测运动员尿液中雄激素结合物，以检验其是否服用兴奋剂。尿液的快速获取与简单处理缩短了获知检测结果的时间，因此，采用LC-MS/MS法检测尿液中雄激素水平是大型赛事的最佳选择。

3 总结与展望

目前，LC-MS/MS法已成为临床实验室用于临床疾病诊断标志物测定的有力武器之一。深入了解人体内源性类固醇激素的变化将有助于更好地筛查和诊断相关疾病。LC-MS/MS法因其高灵敏度和高特异性等特点，使同时监测多种内源性物质成为可能，在多种内分泌和代谢疾病的早期诊断和监测中具有重要意义。利用准确特异的LC-MS/MS法检测尿液样本中类固醇激素能全面阐述其整体代谢轮廓，也使研究者们更加关注尿类固醇激素与临床疾病的关联。本文中提及的方法均经过充分验证，但较多研究在临床相关疾病诊疗中的实际应用还需在大规模人群中验证，且方法提供的参考价值等问题有待进一步确定。LC-MS/MS技术测定尿类固醇激素正在发展中，很多色谱、质谱技术并未应用检测，本综述仅简要介绍了近年来应用于检测尿类固醇激素的方法。由于LC-MS/MS技术检测尿液样本中内源性孕激素的研究极少，且未应用于临床，因此本文并未涵盖所有类固醇激素，尿液孕激素的检测未过多阐述。相信随着LC-MS/MS技术检测尿液类固醇激素的不断完善，研究者们将开发建立更多方法用于检测尿液中的所有类固醇激素，为内分泌及代谢相关疾病寻找潜在的生物标志物，加快LC-MS/MS技术检测尿液类固醇激素在临床中的应用。