乌鳖返春口服液联合PPOS方案对卵巢低储备患者行体外受精-胚胎移植临床结局的影响*

左文婷，郭银华，谈 勇，殷燕云，周 洁，于 茜

（1.南京中医药大学附属医院/江苏省中医院，江苏 南京 210000；2.南通市第一人民医院，江苏 南通 226001）

现代生活中导致不孕的因素增多，包括饮食结构失调、压力、环境污染、辐射等，而不孕症发病率的提高也给临床辅助生殖带来巨大压力[1]。卵巢低储备（diminished ovarian reserve，DOR）是导致女性不孕症的主要原因之一，以储备卵泡少、卵子质量低为特征[2]，患者在辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）治疗期间容易出现卵巢低反应（poor ovarian response，POR）、早发黄体生成素（luteinizing hormone,LH）峰、卵母细胞质量差等情况[3]，如何解决这些问题从而提高活产率仍然是体外受精（in vitro fertilizotion,IVF）/卵胞浆内单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）过程中最具挑战的任务之一[4]。高孕激素下促排卵方案（progestin primed ovarian stimulation，PPOS）是目前临床上认为能有效抑制LH激增的促排卵方案[5]，且因其价格友好、可多次使用累积胚胎，与其他促排卵方案临床结局相当而越来越被生殖科医师青睐。乌鳖返春口服液（苏药制字Z04001287）为我院院内制剂，临床长期用于卵巢低储备患者并取得满意疗效[6]。本研究回顾性分析2019年1月至2021年3月于我科行IVF/ICSI-胚胎移植（ET）助孕的DOR患者103例，探讨乌鳖返春口服液联合PPOS方案对其临床结局的影响，旨在为中医药优化DOR患者ART促排卵方案及妊娠结局提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

1.1.1 不孕症诊断标准 夫妇同居，性生活正常，未避孕未孕1年[7]。

1.1.2 卵巢低储备诊断标准（1）基础卵泡刺激素（FSH）≥10 U/L；（2）阴道B超示双侧窦卵泡（AFC）＜7个；（3）抗米勒管激素（AMH）＜1.1 ng/mL。3项中至少符合两项[8]。

1.1.3 中医诊断标准 参考《中医妇科常见病诊疗指南》[9]及《中医诊断学》[10]中肾阴虚证不孕症诊断标准。主症：（1）婚后1年不避孕未孕；（2）月经量少；（3）经色黯淡质稀；（4）腰膝酸软。次症：（1）头晕耳鸣；（2）潮热盗汗；（3）五心烦热；（4）失眠多梦。以上主症必备，次症具备1～2项，即可诊断。

1.2 纳入标准（1）符合DOR及中医肾阴虚证诊断标准；（2）均符合“卫生部关于修订人类辅助生殖技术与人类精子库相关技术规范、基本标准和伦理原则的通知”[11]中体外受精-胚胎移植（IVF-ET）适应证，无手术禁忌证；（3）均详细告知所有患者DOR可能导致的风险及意外情况，患者均签署知情同意书；（4）均使用PPOS方案促排卵。

1.3 排除标准（1）合并其他内分泌障碍或自身免疫疾病；（2）存在宫腔器质性病变；（3）夫妇其中一方染色体异常；（4）男方患有逆行射精疾病、严重少弱精子症或无精子症，需行附睾或睾丸穿刺术者。

1.4 一般资料 收集2019年1月至2021年3月就诊于南京中医药大学附属医院生殖医学科采用PPOS方案的DOR患者共103例，采用回顾性病例对照研究，根据是否口服乌鳖返春口服液分为观察组（乌鳖返春口服液+PPOS组）52例，对照组（PPOS组）51例。本研究经南京中医药大学附属医院伦理委员会批准通过（方案注册号：ChiCTR-OOC-14005389）。

1.5 治疗方法

1.5.1 对照组 从月经第3天开始口服安宫黄体酮（规格：2 mg/片，浙江仙琚制药，批号：160619）8～10 mg/d，联合注射用尿促性素（human menopausal gonadotropin，HMG，丽珠集团，批号：H10940097）150～300 IU/d，定期监测B超及血激素水平，当2个以上卵泡直径≥18 mm或3个以上卵泡直径≥17 mm时，予人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）（丽珠集团，批号：H44020668）5 000～10 000 IU肌注，36 h后阴道超声引导下行穿刺取卵术。

1.5.2 观察组 在对照组基础上提前予乌鳖返春口服液（组成：炙鳖甲、何首乌、枸杞子、白术、茯苓、续断、黄狗脊，规格10 mL/支，江苏省中医院，苏药制字Z04001287）预处理3个月，于月经干净后开始服用，2次/d，1支/次，至下次月经来潮停服，连续治疗3个月经周期。进入促排卵周期后于促性腺激素（Gn）启动日开始口服，直至取卵后月经来潮，继续口服至冻胚移植周期，确认妊娠则停药。

1.5.3 受精方式、胚胎质量评估及胚胎移植 取卵后根据精子质量选择授精方式（IVF/ICSI），取卵后4～6 h受精，取卵后第3日观察胚胎发育情况，冷冻1～2枚可移植胚胎后其余胚胎继续养囊，囊胚评级依据Gardner标准[12]，第5、6日囊胚内细胞团（ICM）和/或滋养层（TE）细胞达到B级及以上则将囊胚冷冻。移植周期采用人工周期，月经周期第2～3天口服戊酸雌二醇片（商口名：补佳乐，拜耳医药保健）2 mg/次，2次/d，5～7 d后递增至3 mg/次，2次/d，当子宫内膜厚度达标后口服地屈孕酮片（商品名：达芙通，雅培制药）20 mg/d，同时予黄体酮阴道缓释凝胶（商品名：雪诺同，默克雪兰诺）90 mg和（或）黄体酮软胶囊（商品名：安琪坦，BESINS）0.6 g/d阴道内放置，进行内膜转化，3～5 d后移植卵裂期胚胎或囊胚1～2枚。移植后14 d查血HCG，若为阳性，继续用药，于移植后28～35 d阴道B超检查宫内见妊娠囊确定为临床妊娠。

1.6 观察指标

1.6.1 中医证候改善情况 参照《中医妇科常见病诊疗指南》[9]及《中医诊断学》[10]对主、次症进行评分。主症按其无、轻度、中度、重度分别计以0、2、4、6分；次症按其无、轻度、中度、重度分别计以0、1、2、3分。于治疗前及HCG注射日进行证候评分。

1.6.2 临床及实验室指标Gn使用时间、Gn用量、HCG注射日E2水平、HCG注射日LH水平、早发LH峰率、周期取消率[周期取消率=（未取卵周期+未获卵周期+无可移植胚胎周期数）/促排卵总周期数×100%]、MⅡ卵数、双原核受精卵数（2PN）、正常受精率（正常受精率=2PN数/MⅡ卵数）、优质胚胎数、优质胚胎率、囊胚形成率（囊胚形成率=形成囊胚数/进行囊胚培养的胚胎数×100%）。临床妊娠率（临床妊娠率=临床妊娠数/移植周期数×100%）、持续妊娠率（持续妊娠率=妊娠20周以后妊娠数/移植周期数×100%）、活产率（活产率=有活产婴儿的分娩次数/移植周期数×100%）。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，符合正态分布者组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验，不符合正态分布者比较采用秩和检验。计数资料以率（%）表示，两组比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基线资料 两组患者年龄、不孕年限、体质量指数（BMI）、既往移植失败周期、既往无可移植胚胎周期、AMH、基础E2、FSH、LH及AFC比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。（见表1）

表1 两组患者基线资料比较 （±s）

表1 两组患者基线资料比较 （±s）

项目 对照组（n=51）观察组（n=52） t P年龄（岁） 36.22±5.54 34.98±4.86 1.189 0.230不孕年限（年） 3.63±2.87 3.34±2.86 0.498 0.620 BMI（kg/m2） 22.13±3.20 21.73±2.98 0.619 0.530既往移植失败周期（个） 0.84±0.73 0.75±0.68 0.668 0.510既往无可移植胚胎周期（个）0.73±0.67 0.79±0.67 -0.480 0.630 AMH（ng/mL） 1.11±0.82 1.01±0.69 -0.002 0.990 E2（pg/mL） 44.82±19.31 50.25±20.12 -1.350 0.180 FSH（mIU/mL） 9.94±3.64 10.87±7.67 -0.765 0.440 LH（mIU/mL） 3.86±2.39 4.67±3.24 -1.420 0.820 AFC（个） 4.67±2.00 5.00±2.11 -0.800 0.430

2.2 两组患者治疗前后肾阴虚证候积分比较 治疗前两组患者肾阴虚证候积分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。观察组患者HCG注射日肾阴虚证候积分明显低于治疗前（P＜0.01），对照组治疗前后无明显变化。治疗后观察组患者HCG注射日肾阴虚证候积分低于对照组（P＜0.01）。（见表2）

表2 两组治疗前后肾阴虚证候积分比较 （±s）

表2 两组治疗前后肾阴虚证候积分比较 （±s）

注：与本组治疗前比较，aP＜0.01

组别 例数 治疗前 治疗后（HCG注射日）对照组 51 29.12±2.84 28.14±4.64观察组 52 28.96±3.19 14.44±4.40a t 0.262 15.354 P 0.794 0.000

2.3 两组患者临床及实验室指标比较 观察组患者Gn使用时间、Gn用量少于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。观察组患者HCG注射日LH水平、早发LH峰率、周期取消率低于对照组，其中周期取消率比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。观察组患者HCG注射日E2水平、获卵数、MⅡ卵数、2PN数、正常受精率、优质胚胎数、优质胚胎率、囊胚形成率均高于对照组，其中HCG注射日E2水平、获卵数、囊胚形成率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），其余差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见表3）

表3 两组患者临床及实验室指标比较

2.4 两组患者冻胚移植周期比较 对照组19例、观察组26例患者进入移植周期，两组患者解冻后移植胚胎情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。观察组患者移植日子宫内膜厚度、A型子宫内膜比例高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。观察组患者临床妊娠率、持续妊娠率、活产率均高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 两组患者冻胚移植周期比较

3 讨 论

DOR患者在促排卵过程中由于多卵泡发育导致血清E2水平增高，更容易出现早发LH峰，进而导致逸卵、获卵数减少及子宫内膜不同步等一系列问题，因此，选择合适的控制性促排卵（COS）方案有效抑制早发LH峰十分重要[13]。目前临床上常用的促排卵方案包括GnRH-a激动剂方案、GnRH-ant拮抗剂方案、温和刺激方案等，但哪种为DOR女性的最佳选择，尚无统一定论[14]。部分学者认为GnRH-a激动剂方案在降调过程中会使患者出现垂体过度抑制，导致卵巢反应不良[15]，因此不主张对DOR患者采用激动剂方案，而选择拮抗剂、温和刺激等方案。匡延平2015年提出的高孕激素促排卵方案（progestinprimed ovarian stimulation，PPOS）[16]通过在卵泡期口服孕激素抑制下丘脑GnRH的分泌，减缓LH脉冲频率并降低其血浆含量，研究表明，PPOS与拮抗剂、温和刺激方案比较，三者活产率相当，但PPOS的早发LH峰发生率更低[17-18]。因此，笔者认为对于以卵巢反应不良、早发LH峰发生率高为特点的DOR患者，PPOS方案更为适用。

中医学并无“卵巢低储备”病名，根据其临床症状，可归属于“月经后期”“月经过少”“闭经”“不孕”等范畴。《傅青主女科》云：“经水之名者，原以水出于肾……然则经水早断，似乎肾水衰涸。”[19]国医大师夏桂成认为卵巢低储备的病机为肾精亏虚、肾气不足，冲任脉虚，阳明脉衰，脾肾功能进一步衰退，则胞脉、胞宫失养，女性生殖功能减退，乃至不孕。中医药在改善卵巢储备功能方面具有独特优势，可从调节血清性激素水平、改善卵巢局部微循环、抑制颗粒细胞凋亡等多角度发挥优势，改善卵巢储备功能[20]。乌鳖返春口服液（苏药制字Z04001287）为我院院内制剂，方药组成：炙鳖甲、何首乌、枸杞子、续断、白术、茯苓、黄狗脊。其中炙鳖甲、何首乌为君药，滋肾养阴；枸杞子、续断为臣药，补益肝肾；君臣合用滋肾健脾，脾肾双补；白术、茯苓为佐药，健脾祛湿；黄狗脊为使药。全方共奏补肝肾、健脾胃、调冲任功效。经几十年临床实践，乌鳖返春口服液能够提高卵巢功能早衰患者血清E2水平，降低FSH、LH水平，具有雌激素样作用，能改善卵巢功能、延缓卵巢功能衰退[21]。

本研究中，观察组患者Gn使用时间、Gn用量少于对照组，说明乌鳖返春口服液的雌激素样作用能减少Gn用量，缩短Gn使用时间，观察组HCG注射日E2水平、获卵数均高于对照组，尽管两组差异无统计学意义，但在Gn使用时间、Gn用量均显著减少的情况下，HCG注射日E2水平、获卵数有增高趋势，表明乌鳖返春口服液对减轻患者的经济负担具有积极作用。对照组早发LH峰率为5.9%，这与FAN X Y等[22]研究结果相似，而观察组无早发LH峰发生，观察组LH水平低于对照组，尽管两组比较差异无统计学意义，说明乌鳖返春口服液的雌激素样作用并未增加早发LH峰的发生率。观察组MⅡ卵数、2PN数、正常受精率、优质胚胎数、优质胚胎率均明显高于对照组，周期取消率明显低于对照组，说明乌鳖返春口服液能提高卵子质量，增加卵子成熟率，增加MⅡ卵数、2PN数，提高正常受精率，能改善胚胎质量，增加优质胚胎数，提高优质胚胎率，同时降低周期取消率。研究表明，卵母细胞质量与颗粒细胞凋亡增加有关[23]，在ART周期中，卵丘-卵母细胞复合体（COC）水平与凋亡蛋白水平密切相关，但颗粒细胞中凋亡蛋白影响ART结局的潜在机制尚不完全清楚[24]。已有动物实验证实乌鳖口服液对诱导细胞凋亡的关键系统具有调节作用[25]，乌鳖口服液是否通过调节细胞凋亡，进一步改善胚胎质量，从而改善ART结局有待进一步实验研究。观察组囊胚形成率高于对照组，然而差异无统计学意义，可能是样本量小的原因。冻胚移植周期中，两组移植胚胎情况差异无统计学意义，观察组移植日子宫内膜厚度、A型子宫内膜比例均明显高于对照组，说明乌鳖返春口服液能增加子宫内膜厚度，提高A型子宫内膜比例。目前尚无乌鳖返春口服液在子宫内膜方面的研究，后期可进一步深入研究。观察组临床妊娠率、持续妊娠率及活产率均有增高趋势，差异无统计学意义，说明乌鳖返春口服液可能对提高DOR患者的临床妊娠率、持续妊娠率、活产率有积极影响，需进一步扩大样本量，进行前瞻、随机研究，验证其疗效。

综上，乌鳖返春口服液联合PPOS方案能减少Gn用量，减少Gn使用时间，同时能提高卵子质量，提高DOR患者的MⅡ卵数、2PN数，提高正常受精率，能改善胚胎质量，增加优质胚胎数，提高优质胚胎率，降低周期取消率，增加冻胚移植周期患者子宫内膜厚度，提高A型子宫内膜比例，从而临床妊娠率、持续妊娠率及活产率均有增高趋势，值得临床推广和应用。