巴西苏木素对骨关节炎模型中软骨保护作用及内质网应激通路变化的实验研究

黄 滔，瓦庆德，何兴川

(1.遵义医科大学附属医院 关节外科，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学第二附属医院 骨科，贵州 遵义 563000)

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨退化、关节疼痛、滑膜炎为主要表现的慢性退行性疾病，是世界上最常见并致残的疾病之一[1-2]。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，其生物学变化与OA的发生发展密切相关[3]。研究表明，氧化应激是导致骨关节炎的重要因素之一，过度的氧化应激最终会导致软骨细胞凋亡及分化，氧化应激过程中过度的反应性氧化物(Reactive oxidative species,ROS)积累将引发未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)，最终激活内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)途径，诱导软骨细胞凋亡[4-5]，因此OA中软骨细胞凋亡与ERS密切相关。

临床中OA的治疗以基础治疗配合药物治疗为首选方案，主要是改善患者的疼痛症状、抗炎等。如乙酰氨基酚、布洛芬等被作为OA疼痛的一线治疗药物，但这类药物不能从根本解决软骨损伤修复和炎症问题，且长期用药的毒副作用和耐药也是不可避免的[6-7]。巴西苏木素(Brazilin)是苏木的主要活性成分，研究表明Brazilin具有软骨保护和抗炎活性，是用于OA治疗中一种很有前景的预防性药物[8]，其中炎症反应的调控与ERS密切相关[9]。因此本研究探讨的Brazilin是否通过ERS通路来参与OA中软骨细胞损伤修复和炎症的发生过程，具有重要的临床价值。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 巴西苏木素(纯度≥98%)、胶原酶Ⅱ、CCK8试剂盒、甲苯胺蓝染色液、0.25%胰蛋白酶、BCA法蛋白定量试剂盒均购自北京索莱宝公司；Recombinant Rat IL-1购自MCE公司；胎牛血清购自AusGene公司；DMEM高糖培养基购自Gibco公司；GRP78、CHOP、MMP13、β-actin抗体均购自ProteinTech公司；Collagen Type Ⅱ抗体购自杭州华安公司；qRT-PCR相关试剂购自TAKARA公司；引物购自上海生工公司；ECL发光剂购自Tanon公司。

1.2 仪器 低温离心机(美国Thermo Fisher公司)；超声破碎仪(宁波新芝)正置显微镜及照相系统(日本Olympus公司)；微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)、全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司)；CFX96 实时荧光定量PCR仪、Supply Mini Protean 4电泳仪、Mini Trans-Blot转移系统、Chemi Doc成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 实验模型及分组 分离培养SD大鼠出生第4d乳鼠软骨细胞，分组如下：正常软骨细胞组(Control组)，除Control组外，其余组均用IL-1β (10 ng/mL) 处理48 h建立OA体外模型，分为模型组(IL-1β组)、Brazilin低剂量组(2.5 μg/mL)、Brazilin中剂量组(5 μg /mL)、Brazilin高剂量组(10 μg /mL)。

1.4 原代软骨细胞分离 取出生第4天的SD大鼠乳鼠，用75%酒精消毒，在体视显微镜下打开膝关节囊，并用含2%青链霉素混合液的无菌PBS冲洗3次，取出关节表面的软骨组织，用无菌的胶原酶Ⅱ(1 mg/mL)消化液消化3 h，每隔0.5 h晃动1次，最后细胞消化液通过70 μm孔径的细胞筛并接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃，含5% CO2培养箱中进行培养。

1.5 原代软骨细胞鉴定 甲苯胺蓝染色：将细胞爬片用PBS洗2次，晾干后在爬片上滴加200 μL甲苯胺蓝染色液，染色5 min，ddH2O洗2次，晾干后中性树脂封片，镜下观察。

1.6 CCK8检测Brazilin对软骨细胞增殖的影响 将软骨细胞接种于96孔板，每孔1.5×105个细胞，培养48 h后用不同浓度的Brazilin进行处理，每组设5个复孔，继续培养48 h后用每孔加入10 μL CCK8，37 ℃孵育2 h，酶标仪检测490 nm处的OD值，得出细胞活力。

1.7 qRT-PCR检测相关基因表达 收集处理后的细胞，每组加入1 mL Trizol重悬细胞进行裂解，室温静置5 min，加入200 μL 氯仿，充分混匀后室温静置5 min，4 ℃ 12 000 g 离心15 min，取上清转移至新EP管中，加入200 μL 异丙醇，室温静置5 min，4℃ 12 000 g 离心10 min，弃上清，每管用1 mL 75%酒精轻柔重悬沉淀，4℃ 12 000 g 离心10 min，弃上清，置于超净工作台中晾干后用ddH2O溶解，使用NanoDrop one微量分光光度计测定浓度，然后逆转录体系、扩增体系(引物序列如表1所示)按TAKARA公司说明书进行操作。每组样本重复3次，本实验应用2-ΔΔCt法分析目标基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.8 Western blot检测相关蛋白表达 收集处理后的细胞，每组加入120 μL裂解液(RIPA裂解液：PMSR：蛋白酶抑制剂复合物=100∶1∶1)进行裂解，冰上静置15 min，4℃ 12 000 g 离心10 min，上清液转移至新的EP管中，BCA法蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转至PVDF膜上，8%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育一抗GRP78(1∶2 000)、CHOP(1∶1 000)、Collagen Type Ⅱ(1∶1 000)、MMP-13(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，孵育二抗Goat-anti Rabbit(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，滴加ECL显影液并在凝胶成像系统中曝光显影。

1.9 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计，多组间差异比较采用单因素方差分析，进一步两组比较方差齐选用LSD法，方差不齐选用Dunnett’T3法，P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软骨细胞鉴定结果 蛋白聚糖是软骨细胞分泌的机制成分，是软骨细胞功能的主要指标，因此可通过甲苯胺蓝进行鉴定。结果显示，软骨细胞行甲苯胺蓝染色后可见细胞核为蓝色，细胞胞质呈紫蓝色异染反应(见图1A、B)，表明本实验所采用的分离培养方法可获得纯度较高的原代软骨细胞。

A:甲苯胺蓝染色(×100)；B:甲苯胺蓝染色(×200)。 图1 软骨细胞甲苯胺蓝染色鉴定

2.2 Brazilin对软骨细胞增殖的影响 结果显示，不同浓度Brazilin处理软骨细胞48 h后(n=5)，与对照组相比，Brazilin在低浓度可以促进软骨细胞增殖，小于10 μg/mL的浓度对软骨细胞的增殖均无影响，14 μg/mL开始对软骨细胞增殖有显著的抑制作用(P=0.041，见图2)，且呈剂量依赖。因此后续实验高、中、低剂量分别设为10、5、2.5 μg/mL。

* :与对照组比较，P<0.05；**：与对照组比较，P<0.01。图2 不同浓度Brazilin处理对软骨细胞增殖影响

2.3 Brazilin对IL-1β诱导的OA模型细胞形态观察 相差显微镜观察(n=3)，Control组软骨细胞贴壁良好，呈多角形或梭形，折光度均一。IL-1β组可见较多细胞发生皱缩，变圆，折光度降低，并发生细胞脱落现象，Brazilin处理后可缓解这一现象，且呈剂量依赖(见图3)。表明Brazilin可以抑制IL-1β诱导的OA模型中软骨细胞凋亡。

图3 不同浓度Brazilin对OA细胞模型细胞形态的影响

2.4 Brazilin对软骨细胞损伤修复及ERS标志分子表达的影响 PCR结果显示(n=3)，与对照组相比，模型组Collagen Type Ⅱ表达显著下调(P<0.01)， Brazilin低剂量组与模型组无显著性差异，中剂量、高剂量处理后可以显著上调Collagen Type Ⅱ的表达(P<0.01，见图4 A)；与对照组相比，模型组MMP-13表达显著上调(P<0.01)，Brazilin低、中、高剂量处理后，可以下调MMP-13的表达(P<0.01)，见图4 B。与对照组相比，模型组GRP78和CHOP表达显著上调(P<0.01)，Brazilin低、中、高剂量处理后，GRP78进一步上调(P<0.01)，而CHOP表达显著下调(P<0.01)，见图4 C和4 D。Western blot结果表现出了几乎相同的趋势(n=3，见图5 A～E)。以上结果表明IL-1β诱导的OA细胞模型构建成功，ERS途径在OA模型被激活，Brazilin可以通过下调OA模型中MMP-13、CHOP的表达，上调Collagen Type Ⅱ、GRP78的表达，以达到软骨保护作用。

A：各组细胞Collagen Type Ⅱ mRNA的表达变化；B：各组细胞MMP-13 mRNA的表达变化；C：各组细胞GRP78 mRNA的表达变化；D：各组细胞CHOP mRNA的表达变化；*、**:与对照组比较，P<0.05，P<0.01；#、##:与模型组比较，P<0.05，P<0.01。图4 不同浓度BrazilinOA细胞模型中Collagen Type Ⅱ、MMP-13、GRP78、CHOP mRNA的表达

A～E：各组细胞Collagen Type Ⅱ、MMP-13、GRP78、CHOP蛋白的表达变化； *、** :与对照组比较，P<0.05，P<0.01；#、##:与模型组比较，P<0.05，P<0.01。图5 不同浓度BrazilinOA细胞模型中Collagen Type Ⅱ、MMP-13、GRP78、CHOP蛋白的表达

3 讨论

最新的《中国骨关节炎诊疗指南(2021年版)》指出OA的治疗应以基础治疗(运动治疗、物理治疗等)配合药物治疗(镇痛药物、关节腔注射药物等)为首选方案，但目前的药物并不能从根本解决软骨损伤修复问题，因此寻找能够抑制软骨炎症、软骨细胞凋亡、促进软骨细胞损伤修复、再生的药物具有重大的现实意义。天然药用植物及其衍生产物，在治疗慢性及疑难疾病方面具有独特优势，目前天然药用植物及其衍生物用于OA治疗引起广泛关注[10-12]。

OA发病的基本原理是由于关节软骨合成代谢和分解代谢之间的平衡紊乱导致的。而金属蛋白酶-13(MMP-13)构成了分解代谢轴的重要作用。因此，MMP-13作为OA分子研究机制的重要调节因子引起人们极大的关注。大量研究表明，OA患者MMP-13水平显著上调[13-15]，它是目前最有效的Ⅱ胶原蛋白酶(Collagen Type Ⅱ)降解酶[16]，能降解软骨基质中的Ⅱ型胶原，而Collagen Type Ⅱ降解破坏是OA中软骨功能减退的主要原因之一，因此该过程是OA发生、发展过程中的关键事件。本研究在采用IL-1β诱导软骨细胞构建OA细胞模型中，检测到MMP-13的表达上调、Collagen Type Ⅱ表达下调、细胞发生凋亡，表明构建的OA细胞模型能够有效模拟OA患者的软骨损伤状态。

苏木具有活血祛瘀、消肿止痛的功效，常用于治疗跌打损伤、骨折筋伤、瘀滞肿痛等症，巴西苏木素(Brazilin)作为苏木的主要活性成分，已被报道具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、对紫外辐射引起的细胞损伤起保护作用等活性[17-19]。且有研究表明，Brazilin可以抑制TNF-a、IL-1β的释放实现抗炎的功能[20]。而在OA患者的滑液、滑膜和软骨中发现TNF-α、IL-1和IL-6水平异常升高，因此Brazilin对OA的治疗具有极大的研究意义[21-22]。本研究得到Brazilin不影响软骨细胞增殖下的临界浓度，为体内用药提供实验依据，并通过细胞形态学观察到Brazilin可以抑制IL-1β诱导的OA细胞模型中软骨细胞凋亡，且有效逆转MMP-13和Collagen Type Ⅱ的表达，表明Brazilin对于OA软骨的损伤具有一定修复作用。

内质网应激(ERS)是由于环境因素(如ROS、未正确折叠蛋白累积、钙离子平衡紊乱等)造成内质网动态平衡失调，引发的一种亚细胞器应激反应。研究表明，OA中软骨细胞凋亡与ERS密切相关[4-5]，且Brazilin的抗炎活性与ERS密切相关[9]。ERS 信号转导过程程主要由葡萄糖调节蛋白78( Glucose regulated protein 78kD,GRP78)作为内质网的分子伴侣，参与蛋白质的糖基化修饰、折叠和转运[23]。非ERS状态时，葡萄糖调节蛋白78 与内质网膜上的3种跨膜蛋白相结合，即蛋白激酶样内质网激酶(Protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、激活转录因子(Activating transcription factor 6,ATF6)及肌醇需求酶 1(inositol requiring enzyme-1,IRE1)；ERS状态时，GRP78与3种蛋白分离，发生构象改变，进而使3种跨膜蛋白发生磷酸化并激活下游信号通路[24]。轻度ERS时，GRP78表达迅速增加引导蛋白质进行重新折叠等，恢复蛋白质的正确构象，以减轻这些损伤，促进细胞的存活；过度ERS时，内质网失代偿，GRP78表达降低，同时启动内质网相关凋亡程序。C/EBP-homologous protein(CHOP)是ERS特异的促凋亡因子，是由GRP78启动凋亡程序中的标志分子之一，其转录上调是ERS中启动凋亡程序的主要途径，最终导致细胞不可逆的损伤并凋亡[25]。在本研究中，IL-1β诱导的OA模型中软骨细胞发生过度的ERS，导致GRP78显著下调以及CHOP的显著上调，从而诱导软骨细胞的损伤。Brazilin处理后有效逆转GRP78和CHOP的表达，表明Brazilin可能通过ERS途径抑制OA中软骨细胞的损伤。

综上所述，IL-1β能够有效诱导软骨细胞损伤从而构建OA细胞模型，并能通过激活ERS通路促进软骨细胞凋亡，Brazilin通过抑制该途径实现软骨保护作用，为Brazilin在软骨细胞损伤修复中的应用提供了新思路。