HS-SPME-GC-MS技术分析国内不同产地万寿菊花中挥发性成分

刘 超，刘 莉，韦康秦，余家奇，王 刚

(1.遵义医科大学 药学院,贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学第三附属医院 中医科,贵州 遵义 563000)

万寿菊(TageteserectaL.) 为菊科万寿菊属一年生草本植物，头状花序单生，花冠黄色，花期为每年6～10月，别名臭芙蓉、蜂窝菊、里苦艾、万寿灯等[1-3]。万寿菊原产于墨西哥等中美洲国家，主要分布于我国贵州、云南、广西等地。《中华本草》中收载其花，因有香味，可作芳香剂、天然色素及食品香料等。花入药具有清热化痰、补血通经、祛瘀生新之效。据研究，万寿菊化学成分丰富，主要含有生物碱、黄酮等化合物[4-5]，具有抑菌、抗病毒、镇静、降压、抗炎、抗氧化等作用[6-7]。

目前对于挥发油的提取方法有压榨法、有机溶剂萃取法、水蒸气蒸馏法、微波萃取法等[8]。顶空固相微萃取技术(Headspace solid phase microextraction，HS-SPME)是一种使用涂覆有固定相的熔融石英纤维膜来直接吸附挥发性成分的技术[9-10]。该技术集采样、提取和分析于一体，具有操作简便、灵敏度高、耗样量少的优点[11-12]。因此HS-SPME-GC-MS结合使用对挥发油能够进行高效，灵敏和快速的分析，从而实现复杂样品挥发成分的发现，有助于复杂样品系统中痕量挥发性成分的分析。

本实验利用HS-SPME与GC-MS联用技术分析10种不同产地万寿菊花中挥发性成分，利用聚类分析(Clustering analysis)进行分析，为进一步探索万寿菊中挥发性成分的药用价值奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药材 万寿菊药材来源于广西、贵州、云南、安徽、河南等10个产地，如表1所示，经遵义医科大学张玉金副教授鉴定为TageteserectaL。

表1 不同产地万寿菊花样品

1.1.2 仪器与试剂 气相-质谱联用仪P6890-5975C(美国Agilent Technologies公司)；萃取纤维头为：2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex、手动固相微萃取装置(美国Supelco公司)；DEY-400摇摆式高速万能粉碎机(温岭市林大机有限公司)；JJY1002型电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)；加热器(北京康林科技有限公司)；甲醇(成都市科龙化工试剂厂)、二氯甲烷(天津市富宇精细化工有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 10个产地万寿菊花干燥后经粉碎机粉碎过60目筛，分别密封保存备用。

1.2.2 SPME法 根据张鹏云等[13]的SPME方法，取0.5 g万寿菊花粗粉样品，置于固相微萃取仪采样瓶中(50 mL)，插入手动进样器(纤维头为：2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex)，60 ℃下进行50 min顶空萃取，快速将萃取头移出，并插入气相色谱仪进样口(温度250 ℃)中，进行6 min热解析后进样。

1.2.3 GC-MS条件 色谱条件为采用GC-MS联用仪(P6890-5973C)、弹性石英毛细管柱HP-5MS (60 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱温40 ℃ 持续2 min，升温速度：3.5 ℃/min(40～208 ℃)、10 ℃/min(208～288 ℃)；运行时间：58 min；柱前压：16.03 psi；汽化室温度：250 ℃；载气(99.999% 高纯He)流量：1.0 mL/min不分流进样；溶剂延迟3 min。质谱条件：采用EI源为离子源；离子源温度：230 ℃；接口温度：280 ℃；四极杆温度：150 ℃；倍增器电压：2 094 V；电子能量：70 eV；发射电流：34.6 μA；质量范围：29～500 amu。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 精密度试验 按 “2.2、2.3”条件下连续分析6次，对山东样品(S5)中各色谱峰相对保留时间的一致性进行考察。测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于2.0% ，仪器具有良好的精密度。

1.2.4.2 重复性实验 按“2.2和2.3”项下条件操作进样分析，相同积分条件下，考察S5产地万寿菊花中挥发性成分的总峰面积，RSD值均小于2.0%，说明该方法具有良好的重复性，可用于万寿菊植物挥发性成分分析，符合指纹图谱要求。

1.2.4.3 稳定性试验 按“2.2和2.3”条件下操作，在0、2、4、8、12 h分别进样1次，对S5产地万寿菊花中各色谱峰相对保留时间的一致性进行考察。得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于2.0%，表明12 h内样品成分具有良好的稳定性。

1.2.5 共有峰确认及相似度分析 10个产地万寿菊花中挥发性成分在“2.3”项条件下分析，记录图谱，用中药指纹图谱相似度2012版处理图谱，结果表明10种不同产地的药材图谱共有峰的峰面积相似度皆大于0.85，共有峰总共为15个。10批不同产地万寿菊花之间具有高度的一致性和稳定性。

1.2.6 数据分析 Origin2019b版建立万寿菊花指纹图谱；基于各挥发性成分的特征值及峰面积百分率，采用SPSS 18.0软件进行层次聚类分析。

2 结果

2.1 10种不同产地万寿菊挥花中发性成分分析 经HS-SPME-GC-MS萃取分析，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对百分含量，10个产地万寿菊花中共鉴定出66种化合物(见图1、表2)，其中广东产地分离出31种化合物，占总挥发性成分的91.50 %；广西产地分离出23种化合物，占总挥发性成分的98.80 %；贵州产地分离出50种化合物，占总挥发性成分的90.06 %；云南产地分离出出43种化合物，占总挥发性成分的90.76 %；山东产地分离出38种化合物，占总挥发性成分的90.28 %；安徽产地分离出34种化合物，占总挥发性成分的94.18 %；内蒙古产地分离出49种化合物，占总挥发性成分的90.59 %；新疆产地分离出43种化合物，占总挥发性成分的90.02 %；陕西产地分离出22种化合物，占总挥发性成分的92.95 %；河南产地分离出50种化合物，占总挥发性成分的90.38 %。

图1 万寿菊花挥发油指纹图谱

表2 10种产地万寿菊花中挥发性成分及相对含量(%)

续表

按照HS-SPME-GC-MS条件，对10种不同产地万寿菊花中挥发性成分进行分析，总离子流图中各峰经Nist 17和Wiley 275数据库解析及鉴定了万寿菊花中挥发性成分，用峰面积归一化法对各化学成分的相对百分含量进行了测定，结果如图1、表2。鉴定出66种化合物，其中含醛类4种、醇类3种、酮类1种、醚类1种、单萜类33种、倍半萜类19种、酯类1种、呋喃类1种、芳香族类2种、脂肪烃类1种。由表3结果可以看出，单萜类化合物是万寿菊花中主要的挥发性成分，其次是倍半萜类化合物。10个产地万寿菊花中共有成分为柠檬烯、顺-罗勒烯、β-罗勒烯、萜品油烯、三甲基苯甲醇、香芹酚、胡椒酮、橙化基丙酮、β-石竹烯、金合欢烯、β-芹子烯、α-紫穗槐烯、吉马烯、油烯醇、石竹素15种成分，可见不同产地万寿菊花中相对含量及成份存在联系的同时也具有差异。

表3显示，10个产地万寿菊花中挥发性成分含量较高的为单萜类和倍半萜类成分。其中广东产地的单萜类、倍半萜类分别占挥发性成分含量的19.08 %、70.87 %；广西产地的单萜类和倍半萜类分别占挥发性成分含量的38.00 %、57.54 %；贵州产地的单萜类、倍半萜类分别占挥发性成分含量的60.18 %、23.67 %；云南产地的单萜类、倍半萜类分别占挥发性成分含量的57.30 %、28.98 %；山东产地的单萜类、倍半萜类分别占挥发性成分含量的40.35 %、45.85 %；安徽产地的单萜类、倍半萜类分别占挥发性成分含量的46.26 %、43.09 %；内蒙的单萜类、倍半萜类分别占挥发性成分含量的58.61 %、42.06 %；新疆产地的单萜类、倍半萜类分别占挥发性成分含量的42.72 %、26.67 %；陕西产地的单萜类、倍半萜类分别占挥发性成分含量的34.26 %、26.86 % ；河南产地的单萜类、倍半萜类分别占挥发性成分含量的62.08 %、23.10 %。由此可见单萜类和倍半萜类化合物是万寿菊花的主要化学成分。

表3 10种不同产地万寿菊花中挥发性成分比较

在10个不同产地万寿菊花中，挥发性成分含量超过1 %的主要有柠檬烯(4.67 %～12.75 % )、顺-罗勒烯(0.42 %～1.86 %)、β-罗勒烯(0.36 %～8.73 %)、萜品油烯(0.40 %～16.63 %)、三甲基苯甲醇(0.57 %～6.55 %)、月桂烯(0.22 %～5.70 %)、氧化罗勒烯 (0.99 %～8.23 %)、胡椒烯酮醚(0.90 %～1.54 %)、胡椒酮(1.04 %～13.12 %)、薄荷烯酮(0.17 %～1.72 %)、β-石竹烯(18.04 %～51.21 %)、金合欢烯(0.21 %～5.51 %)、吉马烯(0.41 %～4.79 %)、喇叭烯(0.10 %～1.65 %)、石竹素(0.22 %～2.40 %)等成分。其中石竹烯主要用于配制精油仿制和日化香精[14]，胡椒酮和萜品油烯具有祛痰、平喘、止咳、抗菌的作用，胡椒酮不仅对吸烟者呼吸道有良好的保护效果，还可降低吸烟者呼吸道病变，可作为制作功能型卷烟的一种理想添加剂[15]，柠檬烯具有抗氧化、抑菌防腐、杀菌、抗肿瘤、水果饮料和冰淇淋的调味剂等作用[16-17]，本研究分离了10种类型共计66种化合物，将数据导入SPSS 18.0进行主成分分析和层次聚类分析。

2.2 层次聚类分析 对10种产地万寿菊花进行层次聚类分析，将数据导入SPSS18.0软件，聚类方法采用组间联接，测度：平方Eclidean距离，基准：峰面积百分率，得树状图。由图2可知，当类间聚为10时分为4类，云南、新疆、贵州、河南的万寿菊花为一类；产地安徽、内蒙、山东、陕西的万寿菊花为一类；广西的万寿菊花为一类；广东的万寿菊花为一类。整个聚类过程在该图2中得到直观显示，减少了主观判断引起的失误，结果表明10种产地万寿菊花的成分具有相似之处，同时也存在差异。

图2 10个产地万寿菊花聚类分析结果

3 讨论

采用HS-SPME-GC/MS联用技术分析10个不同产地万寿菊花中挥发性成分，分离出66种成份。10个产地相同化学成分有15种，其中柠檬烯(4.67 %～12.75 %)、β-罗勒烯(0.36 %～8.73 %)、萜品油烯(0.40 %～16.63 %)、β-石竹烯(18.04 %～51.21 %)等含量较高，可以作为万寿菊花挥发油质量标志物，对今后万寿菊花的鉴定和品质研究提供一个参考。不同产地相同挥发性成分含量存在较大差异，β-石竹烯含量分别为广东51.21 %、广西48.37 %、贵州18.04 %、云南23.39 %、山东36.97 %、安徽36.27 %、内蒙34.47 %、新疆23.21 %、陕西41.55 %、河南18.17 %，可能是不同地区受土壤、气候等环境因素的影响。

通过对HS-SPME-GC/MS分析出的有效数据进行处理，10个不同产地万寿菊花中挥发性成分含量存在差异；聚类分析将不同产地万寿菊花分为4类，反映出不同产地万寿菊花间的共性和差异与其它们之间的亲缘关系。以上数据为进一步研究万寿菊质量评价提供参考与借鉴。