高效液相色谱法同时测定徐长卿提取物中6种酚酸类成分含量

2022-11-11李志霞李正国

中国药业 2022年21期

李志霞，李正国

（山东省济宁市食品药品检验检测研究院，山东济宁 272025）

徐长卿始载于《神农本草经》，又名鬼督邮、别仙踪、一枝香、老君须等，为萝藤科植物徐长卿Cynanchum paniculatum（Bge.）Kitag.的干燥根或根茎。性温，味辛，归肝经、胃经，具有祛风除湿、行气活血、祛痛止痒、解毒消肿功效，主治风湿痹痛、脘腹疼痛、牙痛、跌扑伤痛、泄泻、痢疾、荨麻疹、毒蛇咬伤等[1-2］。徐长卿富含挥发油类、C21甾体类、黄酮类、生物碱类、多糖类等成分[3-6］。现代药理学研究表明，其具有抗肿瘤、保护软骨细胞、抗炎、镇痛、抗病毒等作用[7-12］。目前的研究中仅将丹皮酚作为其检测指标性成分，检测指标较局限。本研究中通过提取纯化方法制备徐长卿提取物，采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定徐长卿提取物中绿原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚的含量，旨在为徐长卿医药保健产品的开发奠定基础。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（美国沃特世公司），配有Empower色谱工作站；ZFS型旋转蒸发仪（青岛聚创世纪环保科技有限公司）；Gilson型移液枪（吉而逊实验仪器＜上海＞有限公司）；RE30型超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司，功率为320 W，频率为30 kHz）；真空干燥机（上海一恒医疗器械有限公司）；BS型电子天平（德国Sartorius公司，精度为0.01 mg）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号为110753-202018，纯度≥96.1%），香草酸对照品（批号为110776-201503，纯度≥99.8%），橙皮苷对照品（批号为110721-201818，纯度≥96.2%），丹皮酚对照品（批号为110708-201908，纯度≥99.8%），均购自中国食品药品检定研究院；丹皮酚原苷对照品（九鼎生物科技有限公司，批号为P1879，纯度≥98%）；白前苷B对照品（四川艾克瑞思检测技术有限公司，批号为202019，纯度≥98%）；徐长卿提取物（实验室自制，批号分别为20210705，20210816，20210906，以下简称a，b，c）；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；纯化水（自制）；其余试剂均为分析纯；徐长卿药材购自安徽亳州中药材市场，经我院李正国主任中药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～19 min时10%B～33%B，19～32 min时33%B～58%B，32～46 min时58%B～83%B，46～58 min时83%B～90%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：275 nm；柱温：40℃；进样量：10µL。

2.2 徐长卿提取物制备

称取徐长卿适量，粉碎，过24目筛，加纯化水回流提取3次，第1次加13倍量水，提取1 h，第2次和第3次均加10倍量水，提取1 h，合并提取液，滤过，减压浓缩（-0.10 MPa，＜80℃）至相对密度为1.20（室温），加乙醇充分搅拌，并使含醇量达60%，静置24 h，滤过，得醇沉清液。醇沉清液先过001×7阳离子树脂，收集流出液，回收乙醇，经大孔树脂[HPD300-HPD826（1∶1.5，V/V）］吸附，大孔树脂用水洗[3 BV（柱体积）］，用60%乙醇4 BV进行洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。

2.3 溶液制备

混合对照品溶液：取绿原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚对照品各适量，精密称定，置100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成绿原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚质量浓度分别为158.3，98.5，102.4，114.5，105.6，124.7µg/mL的混合对照品溶液，备用。

供试品溶液：取2.2项下徐长卿提取物100 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇超声使溶解，用乙腈定容，摇匀，即得。

2.4 方法学考察

专属性试验：取2.3项下混合对照品溶液和供试品溶液各10µL，按2.1项下色谱条件进样分析，色谱图见图1。可见，绿原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚6种成分的分离度良好，专属性强。

图1 高效液相色谱图1.Chlorogenic acid 2.Vanillic acid 3.Hesperidin 4.Paeonolide 5.Vincetoxicosid B 6.Paeonol A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.3项下混合对照品溶液10，5，2.5，1，0.5，0.25 mL，分别置10 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，得绿原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚质量浓度分别为3.957 5，7.915，15.83，39.575，79.15，158.3µg/mL，2.462 5，4.925，9.85，24.625，49.25，98.5µg/mL，2.56，5.12，10.24，25.6，51.2，102.4µg/mL，2.862 5，5.725，11.45，28.625，57.25，114.5µg/mL，2.64，5.28，10.56，26.4，52.8，105.6µg/mL，3.117 5，6.235，12.47，31.175，62.35，124.7µg/mL的系列对照品溶液。按2.1项下色谱条件进样分析，并记录峰面积，以对照品溶液质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果各成分在其质量浓度范围内与峰面积线性关系均良好，详见表1。

精密度试验：精密吸取绿原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚质量浓度分别为15.83，9.85，10.24，11.45，10.56，12.47µg/mL的混合对照品溶液10µL，按2.1项下色谱条件重复进样测定6次。结果见表1，表明仪器精密度良好。

重复性试验：精密称取徐长卿提取物（批号为b）100 mg，平行6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果见表1，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.3项下供试品溶液适量，分别于0，1，2，3，6，9，15，30 h时进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果见表1，表明供试品溶液在30 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的徐长卿提取物（批号为b）50 mg，精密称定，平行6份，加60%乙醇超声使溶解，精密吸取绿原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚质量浓度分别为15.83，9.85，10.24，11.45，10.56，12.47µg/mL的混合对照品溶液4 mL，置10 mL容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，得供试品溶液。经0.45µm微孔滤膜滤过，进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 线性关系考察、精密度、重复性、稳定性及加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test，precision repeatability，stability tests and recovery test（n=6）

2.5 样品含量测定

取3批（批号分别为a，b，c）徐长卿提取物各100 mg，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定3次，记录峰面积，并计算含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）Tab.2 Results of the content determination of six phenolic acids in samples（n=3）

3 讨论

3.1 检测波长选择

绿原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚各对照品分别经紫外全波长扫描，结果分别在326，261，283，278，268/371，275 nm波长处有最大吸收，在275 nm波长处的色谱峰峰形及基线均良好，综合考虑，选择275 nm作为检测波长。

3.2 流动相选择

考察了甲醇-0.2%甲酸、甲醇-0.2%醋酸、甲醇-0.1%磷酸及相应乙腈体系的流动相，发现乙腈-0.2%甲酸体系的基线平稳、色谱峰峰形及分离度均显著好于其他流动相，且色谱图中的绿原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚的保留时间均良好，故选择乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相。

3.3 大孔树脂选择

采用大孔树脂联用纯化徐长卿提取物，前期通过筛选多种型号的大孔树脂发现，HPD300和HPD826 2种型号大孔树脂联用的纯化效果较好，其最佳混合比为1∶1.5（V/V）。HPD826能较好地保留有机酸类及黄酮苷类成分，如绿原酸、香草酸、橙皮苷等；HPD300能较好地吸附弱极性的甾体类、萜类及黄酮类成分。两者混用可对不同类成分进行吸附，使徐长卿中相关成分达到最大保留。

3.4 考察指标选择

选择绿原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B、丹皮酚6种成分作为考察指标，初步探索在本工艺条件下制备的徐长卿提取物成分的含量。结果发现，徐长卿提取物中丹皮酚、丹皮酚原苷和绿原酸的含量相对较高，香草酸、橙皮苷和白前苷B亦有较高的含量。结合丹皮酚和绿原酸在肝损伤、肝纤维化、肝脂肪堆积等肝病方面的功效显著[13-16］，进一步推测徐长卿中高含量的丹皮酚和绿原酸可能是其归肝经的物质基础。