miR-101-3p靶向E2F2调控黑色素瘤细胞增殖的分子机制探讨

李吻吻，朱智鑫，韩利民，焦艳林，翁宗琴，赵海龙

黑色素瘤是一种进展快、预后差、病死率高的皮肤恶性肿瘤。目前黑色素瘤的治疗方式主要包括传统的手术、放化疗及近年来新兴的靶向和免疫治疗。放化疗对患者具有较大的不良反应且肿瘤容易复发［1］。手术切除适用于早期的黑色素瘤且预后较好，但黑色素瘤患者早期症状不明显，临床上易被误诊、漏诊。研究表明，多种肿瘤均具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）高度依赖性特点，而NAD+合成的关键限速酶烟酰胺磷 酸核糖基转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）相关抑制剂也被认为对黑色素瘤具有潜在治疗作用［2］。但有研究发现，NAMPT抑制剂在临床试验中具有潜在的视网膜毒性，同时影响患者的生活质量［3］。因此探索NAMPT下游相关蛋白对黑色素瘤的治疗具有重要意义。E2F转录因子家族与肿瘤细胞周期进程、凋亡、增殖、分化以及DNA损伤和修复均密切相关，是目前肿瘤治疗靶点研究的重点［4］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种长20～22个核苷酸的微小非编码RNA，能通过与靶基因的3'-非翻译区（untranslated region，UTR）结合，引发mRNA降解或翻译抑制，最终负性调控靶基因的表达［5］。本研究拟探究转录因子E2F2和miRNA在调控黑色素瘤细胞增殖过程中的作用及相关潜在调控分子机制，进一步明确调控E2F2能否成为药物治疗黑色素瘤的特异性靶点，旨在为黑色素瘤的治疗提供更多策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系及动物 人黑色素瘤细胞系MV3购自厦门逸漠生物科技有限公司，来源于淋巴结转移性黑色素瘤患者。6只SPF级雌性裸鼠（4～5周龄，体质量16～17 g）购自中国北京斯贝福生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010，动物使用许可证号：SYXK（黔）2021-0003。

1.1.2 试剂 高效RIPA裂解液、MTT噻唑蓝粉末（250 mg）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）、牛血清白 蛋 白（BSA）购 自 中 国Solarbio公 司；Trizol购 自 美 国Invitrogen公司；总RNA逆转录和荧光定量PCR（qPCR）试剂盒购自日本Takara公司；RPMI 1640培养基、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素购自中国源培公司；胎牛血清（FBS）购自美国GEMINI公司；0.25%Trypsin-EDTA购自美国Gibco公司；miR-101-3p mimics（5'-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3'）、NC mimics（5'-GGAAGUCAUCCAAUGUGCAUU-3'）、shRNA质粒pLKO.1购自上海GenePharma有限公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司；大鼠抗人BrdU抗体、兔抗人GAPDH、E2F2、p21、细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）、细胞周期蛋白E（CyclinE）、LC3B抗体购自英国Abcam公司；兔抗人AKT抗体、Phospho-AKT（Ser473）抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗购自美国Invitrogen公司。

1.2 抑制E2F2表达对黑色素瘤细胞增殖及相关恶性生物学行为的影响

1.2.1 生物信息学分析 采用GEPIA（http://gepia.canc erpku.cn/detail.php/）以及OSskcm（http://bioinfo.henu.edu.cn/Melanoma/MelanomaList.jsp/）在线生存分析工具鉴定E2F2在黑色素瘤中的表达及对预后的影响。通过癌症相关的单细胞数据库CancerSEA（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）分析E2F2在黑色素瘤中参与的主要细胞功能。

1.2.2 MV3细胞培养 采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基培养MV3细胞，将其置于5%CO2、37℃恒温环境中。

1.2.3 质粒与慢病毒转染 将293T细胞进行常规铺板、消化和收集（1×106个），按照Lipofectamine 2000试剂说明书制备质粒DNA-脂质体复合物。接着将质粒DNA-脂质体复合物加入到293T细胞中，于48 h收集含有病毒的上清液，3 000 r/min离心20 min后取上清液备用。将MV3细胞按1×105个/孔均匀铺在6孔板中，次日在细胞覆盖率达70%～80%时去除原有培养基，加入含4 g/L聚凝胺的新鲜培养基和适量的病毒悬液，24 h后将含病毒的培养基更换为新的完全培养基。转染48 h后用显微镜观察细胞内荧光信号以确定转染效率，并在72 h加入4 g/L的嘌呤霉素进行筛选，最后收集抗药细胞并进行扩张和鉴定。设计以慢病毒为载体短发夹RNA（shRNA）针对不同蛋白的靶序列，E2F2 shRNA：5'-GCCTATGTGACTTACCAGGAT-3'，GFP shRNA：5'-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCA-3'。

1.2.4 流式细胞术测定细胞周期 分别用shGFP和shE2F2慢病毒载体感染MV3得到所需的细胞系。收集细胞并进行计数，以每孔1×106个细胞接种在6孔板中，以shGFP组为对照组。72 h时取出6孔板，用PBS洗涤2次后，胰酶消化1 min，离心收集细胞，重悬细胞至1×106个/mL。取1 mL细胞悬液进行离心，使用体积分数为70%的预冷乙醇固定过夜。次日取出细胞后PBS再次使用洗涤1次，在避光条件下加100µL RNase A溶液重悬细胞，37℃水浴30 min。接着加入400µL PI染色液，4℃避光孵育30 min后使用流式细胞仪进行检测。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖能力shGFP或shE2F2处理MV3细胞，在MV3细胞生长状态良好时，将细胞稀释至2.5×105个/mL，取200 µL细胞悬液接种到96孔板，放入37℃、5%CO2恒温箱中培养过夜。最终以0.1%的DMSO为对照组，根据不同时间点取出96孔板，并向每孔中添加20 µL的MTT溶液（5 g/L）继续培养4 h。移液器去除培养液，每孔加入150µL DMSO溶液，室温下摇床上摇晃10 min至蓝紫色结晶甲臢完全溶解。最后采用全波长酶标仪读取490 nm处的光密度（OD）值。实验重复3次。

1.2.6 Western blot检测E2F2、CyclinE、CDK2、AKT、p-AKT、p21蛋白相对表达水平 收集各组细胞提取蛋白，4℃离心收取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。制备10%SDS-PAGE凝胶，每孔以30 µg蛋白进行上样，电泳后转至PVDF膜，5% BSA封闭2 h。接着加入兔源一抗E2F2、CyclinE、CDK2、AKT、p-AKT、p21（均为1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000），置于4℃冰箱过夜。次日首先取出孵育盒室温复苏30 min，TBST洗膜3次，加入山羊抗兔IgG（1∶10 000），室温孵育2 h。TBST洗膜3次，完毕后采用化学发光仪进行显影。

1.2.7 免疫荧光法检测LC3B的表达水平 将各组细胞按1×105个/孔铺入含有载玻片的12孔板中。72 h取出12孔板，依次进行4%多聚甲醛固定10 min、0.3% TritonX-100通透5 min、5%BSA封闭2 h。接着加入一抗LC3B（1∶200），4℃过夜处理。次日，PBS清洗后加入山羊抗兔IgG（1∶1 000）。在室温下孵育2 h后用DAPI进行细胞核染色15 min。采用PBS漂洗干净后在显微镜下观察，最后封片后采用荧光显微镜进行拍照。

1.2.8 体内成瘤实验 裸鼠饲养于SPF环境，室温控制在（22±2）℃，昼夜各半循环照明，自由摄食和饮水。根据实验要求分别对MV3进行shGFP或shE2F2转染成功后得到所需的细胞系。适应1周后随机抽取6只裸鼠分为shGFP组和shE2F2组，分别皮下注射转染shGFP或shE2F2的MV3细胞。取对数生长期的各组细胞，加入2 mL PBS后重悬，细胞调整为5×106个/mL，采用1 mL注射器分别取200µL细胞悬液冰上待用。选择裸鼠右侧腋中线向后0.5 cm处皮下注射，每5 d评估1次肿瘤生长变化。注射4周后通过颈椎脱位处死所有小鼠，取出肿瘤并进行拍照和称质量。

1.3 过表达miR-101-3p对黑色素瘤细胞恶性生物学行为的影响

1.3.1 细胞转染 将MV3细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，分别转染miR-101-3p mimics（10 nmol/L），NC mimics（10 nmol/L）。细胞在转染48 h后用于后续实验，采用qPCR检测其转染效率。

1.3.2 qPCR检测miR-101-3p和E2F2的表达水平 将NC mimics组或miR-101-3p mimics组MV3细胞按5×105个/孔均匀铺在6孔板中，收集细胞后检测MV3细胞中miR-101-3p表达水平和E2F2的mRNA表达水平。RNA试剂盒提取各组细胞的总RNA，按照反转录试剂盒说明书将提取的RNA（miR-101-3p用加尾法）反转录成cDNA，其中miR-101-3p的反转录引物为5'-GGAGTAGATGATGGTTAGCGTCGGCAATTCAGTTGAGTTCAGTTA-3'，U6的反转录引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。之后使用qPCR仪进行荧光定量PCR反应，反应条件：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共40个循环。检测结果miR-101-3p以U6作为内参基因，E2F2以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算。引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计及合成，序列见表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3.3 BrdU检测细胞的增殖能力 收集各组细胞，进行细胞计数，按每孔1×104个细胞加入铺有载玻片的24孔板中，置于37℃、5%CO2恒温箱培养。根据实验要求时间点取出24孔板，并加入10 mg/L的BrdU使其终浓度为30 µg/L。孵育30 min后依次进行PBS清洗，4%多聚甲醛（PFA）固定15 min，0.3%Triton X-100通透5 min，1 mol/L HCl处理10 min，10%山羊血清封闭1 h。最后用一抗BrdU（大鼠单克隆抗体，1∶300）孵育1 h，山羊抗大鼠IgG（H+L，1∶100）室温避光下孵育1 h。细胞核用DAPI染色液进行染色，最后用显微镜进行拍摄。

1.4 统计学方法 所有实验数据使用SPSS 17.0进行统计学分析，采用均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用成组t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E2F2在黑色素瘤中的表达及与预后的关系GEPIA及OSskcm在线生存分析结果均证实E2F2表达水平升高的黑色素瘤患者预后更差（P＜0.01），见图1。

2.2 抑制E2F2表达对黑色素瘤细胞增殖及相关恶性生物学行为的影响CancerSEA数据库分析结果表明，E2F2主要与DNA修复和细胞周期等功能显著相关，见图2。流式细胞术检测结果显示，与shGFP组相比，shE2F2组中处于G0/G1期的细胞比例显著增多（P＜0.01），见图3。MTT结果表明，与shGFP组相比，shE2F2组MV3细胞活力明显减弱（P＜0.05），见图4。Western blot结果表明，shE2F2组相较于shGFP对照组E2F2蛋白表达水平显著下调（0.56±0.06vs.0.86±0.09，t=3.941，P＜0.05），并同时出现CyclinE（0.36±0.02vs.0.66±0.11，t=3.908，P＜0.05）和CDK2（0.28±0.04vs.0.54±0.12，t=2.841，P＜0.05）表达水平显著降低，与之前流式细胞结果显示的细胞周期阻滞情况相符，见图5。此外，与shGFP对照组相比，shE2F2组中E2F2靶蛋白AKT磷酸化水平出现显著下降（0.19±0.04vs.0.11±0.02，t=2.984，P＜0.05），同时下游细胞周期阻滞相关蛋白p21表达上调（0.59±0.04vs.0.81±0.08，t=3.734，P＜0.05），说明E2F2通过靶向AKT进而抑制p21表达，见图6。免疫荧光结果显示，与shGFP组（33.00%±10.15%）相比，shE2F2组（4.00%±1.73%）细胞中自噬相关蛋白LC3B荧光信号细胞占比明显降低（n=3，t=4.879，P＜0.05），见图7。shE2F2组裸鼠体内黑色素瘤的质量显著低于shGFP组［（0.55±0.11）gvs.（1.33±0.07）g，n=3，t=10.400，P＜0.01］，见图8。

Fig.1 Survival curves of melanoma patients with different expression levels of E2F2图1 E2F2不同表达水平的黑色素瘤患者生存曲线

Fig.2 CancerSEA database analyzes the functional diagram of E2F2 in melanoma图2 CancerSEA数据库分析黑色素瘤中E2F2的功能图

Fig.3 The changes of cell cycle detected by PI staining flow cytometry after shGFP or shE2F2 treatment图3 shGFP或shE2F2处理后PI染色流式细胞术检测细胞周期的变化

Fig.4 The effect shGFP or shE2F2 on cell viability of MV3 cells detected by MTT图4 MTT法检测shGFP或shE2F2处理后对MV3细胞活力的影响

Fig.5 Expression of cycle-related proteins in MV3 cells treated with shGFP or shE2F2图5 shGFP或shE2F2处理后MV3细胞周期相关蛋白的表达

Fig.6 Expression changes of p-AKT,AKT and p21 in MV3 cells treated with shGFP or shE2F2图6 shGFP或shE2F2处理后MV3细胞中p-AKT、AKT和p21表达变化

2.3 miR-101-3p靶向调控E2F2表达StarBase数据库分析发现miR-101-3p能与E2F2 mRNA的3'-UTR结合，见图9。与NC mimics组相比，miR-101-3p mimics组miR-101-3p的表达上调（1.23±0.20vs.5.54±1.16，t=6.324，P＜0.01）。miR-101-3p mimics组E2F2的mRNA表达低于NC mimics组（0.29±0.05vs.1.00±0.00，t=24.000，P＜0.01）。同 时，与NC mimics组相比，miR-101-3p mimics组E2F2蛋白水平出现下调（0.58±0.06vs.0.12±0.03，t=9.565，P＜0.01），见图10。

Fig.7 The changes of LC3B fluorescence signal of MV3 cells after shGFP or shE2F2 treatment图7 shGFP或shE2F2处理后MV3细胞中LC3B荧光信号变化

Fig.8 The effect of shE2F2 on the growth of melanoma in vivo图8 shE2F2对黑色素瘤体内生长的影响

Fig.9 The binding sequence diagram between miR-101 and the 3'-UTR sequence of E2F2 predicted by StarBase图9 StarBase预测miR-101与E2F2的3'-UTR序列之间的结合序列图

Fig.10 Protein expression levels of E2F2 in MV3 cells treated with NC or miR-101-3p mimics图10 NC mimics或miR-101-3p mimics处理后MV3细胞中E2F2的蛋白表达水平

2.4 过表达miR-101-3p mimics对黑色素瘤细胞增殖能力的影响MTT结果表明，与NC mimics组相比，miR-101-3p mimics组MV3细胞的活力在5 d时显著降低（P＜0.01），见表2。BrdU标记试验结果显示miR-101-3p mimics组细胞中BrdU阳性信号细胞占 比（23.43%±2.41%）较NC mimics组（45.70%±2.60%）明显减少（n=3，t=10.880，P＜0.01），见图11。

Tab.2 Comparison of MV3 cell viability after treatmentwith NC mimics and miR-101-3p mimics between the two groups表2 NC mimics和miR-101-3p mimics处理后2组MV3细胞活力比较 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of MV3 cell viability after treatmentwith NC mimics and miR-101-3p mimics between the two groups表2 NC mimics和miR-101-3p mimics处理后2组MV3细胞活力比较 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

组别NC mimics组miR-101-3p mimics组t 1 d 0.18±0.02 0.19±0.02 0.692 2 d 0.38±0.03 0.36±0.03 0.711 3 d 0.74±0.05 0.68±0.04 1.779 4 d 1.11±0.16 0.87±0.08 2.336 5 d 1.90±0.05 1.26±0.12 8.784＊＊

Fig.11 BrdU positive staining in MV3 cells treated with NC mimics or miR-101-3p mimics图11 NC mimics或miR-101-3p mimics处理后MV3细胞中BrdU阳性染色图

3 讨论

恶性黑色素瘤致死率高且容易早期转移，传统手术治疗并不能延长患者生存时间。研究表明靶向和免疫治疗能提高患者的生存率，但在临床上患者对其反应率并不高，这在一定程度上限制了其治疗效果［6］。因此，探索更佳的治疗策略仍是现阶段面临的难题之一。

3.1 E2F2在黑色素瘤中的表达及作用E2F2是一种转录因子，属于E2F家族成员之一。既往研究表明家族中E2F1表达增高的患者更易侵袭且预后更差，能够促进黑色素瘤的转移和复发［7］。本研究团队在之前研究中发现，E2F2位于黑色素瘤NAD+依赖性的网络信号转录枢纽中心，受NAMPT调控，参与调控黑色素瘤细胞增殖与凋亡［8］，但其具体机制并不清楚。体内和体外证据表明E2F2与肝癌［9-10］、乳腺癌［11］、宫颈癌［12］、胃癌［13］等恶性肿瘤均密切相关，有望成为肿瘤预后分析的生物标志物和治疗靶标。但是E2F2在不同类型肿瘤中的作用并不一致，其可能充当肿瘤抑制因子，也可能充当肿瘤激活因子［4］。目前E2F2与黑色素瘤的研究较少，两者关系尚不清楚。本研究生物信息学分析结果发现，E2F2表达升高的黑色素瘤患者总体存活率明显低于低表达者。利用shRNA敲低E2F2表达后，G0/G1期细胞比例明显升高，细胞周期蛋白CyclinE、CDK2表达明显下调，体内实验结果进一步证实E2F2表达降低后黑色素瘤的生长明显受抑制。以上研究均提示E2F2是恶性黑色素瘤的潜在诊断标志物及治疗靶点。

3.2 shE2F2处理后对黑色素瘤细胞增殖和自噬的影响 自噬是溶酶体对非功能性蛋白进行降解、促进营养物质重新利用的过程，因此其曾被认为是一种自我保护反应［14］。自噬和凋亡均与肿瘤的发生和发展有关，两者具有紧密的内在联系。缺血、缺氧、炎症等应激引发的轻度或中度自噬能保护细胞免受损伤，但过度自噬反而会引起细胞发生凋亡［15］。本研究中，免疫荧光结果显示shE2F2处理后LC3B的荧光信号明显减少，说明自噬水平显著降低，同时细胞增殖和自噬调控相关蛋白p-AKT的表达水平降低，并进而导致细胞周期阻滞蛋白p21表达上调，导致细胞分裂过程停滞，进而影响黑色素瘤细胞增殖水平，以上结果表明E2F2介导AKT的磷酸化水平，进而影响黑色素细胞的增殖和自噬水平。

3.3 miR-101-3p对黑色素瘤细胞增殖的影响 研究表明miR-101与恶性肿瘤的增殖和转移有关，在肝癌［16］、结肠癌［17］、鼻咽癌［18］、淋巴瘤［19］等多种恶性肿瘤中表达下调，而上调miR-101的表达水平能显著抑制肿瘤增殖。通过StarBase数据库分析发现miR-101-3p能与E2F2 mRNA的3'-UTR特异性 结合，本研究在MV3细胞中过表达miR-101-3p后发现E2F2的mRNA和蛋白表达均显著降低，这表明E2F2可能是miR-101-3p的靶基因之一；而MTT实验和BrdU实验均表明miR-101-3p可以显著降低黑色素瘤细胞的活力和增殖水平，提示miR-101-3p靶向E2F2并抑制其表达，进而降低黑色素瘤细胞增殖水平，最终达到抑制肿瘤的结果。同时，Wandler等［20］研究表明与皮肤痣相比，黑色素瘤中miR-101的表达明显下调，而BRAF突变的转移性黑色素瘤中miR-101的表达较野生型转移性黑色素瘤明显降低，这与本研究结果一致。

综上所述，miR-101-3p靶向介导黑色素瘤中转录因子E2F2表达，而E2F2不仅在黑色素瘤的辅助诊断及预后评估中具有重要作用，而且有可能成为临床治疗黑色素瘤的潜在靶点。今后的研究中笔者将继续深入探究E2F2及其相关信号通路在黑色素瘤发生发展中的分子机制，并研发以miR-101-3p为靶点的小分子药物等，改善临床治疗效果。