文蛤防御素基因的克隆及其免疫表达特征研究

周烨

（通州区兴仁镇农业农村和社会事业局，江苏 南通 226300）

防御素（Defensins）是一类阳离子抗菌活性肽，广泛存在于各种生物体中，是生物体先天免疫防御和适应性免疫防御机制的重要组成部分[1-3]。通常防御素都是小分子肽，由12～50个氨基酸构成，分子内富含精氨酸和由半胱氨酸形成的分子内二硫键[4]。最初在鲎（Tachypleus tridentatus）中发现了一个具有79 aa的防御素基因，被命名为Big Defensin（MmBD），作为抗菌肽家族（AMPs）的一员，该基因具有显著的抗菌活性[5]。随后在多个软体动物中开展了big Defensin基因的相关研究，包括菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinesis）[6]、海湾扇贝（Argopecten irradians）[7]、美洲帘蛤（Mercenaria mercenaria）[8]、魁蚶（Scapharca broughtonii）[9]等。以上研究表明，big defensin基因在免疫应答中发挥着重要作用。目前在关于文蛤（Meretrix meretrix）的研究中，还未见该基因的相关报道。

文蛤，属软体动物门，瓣鳃纲，帘蛤目，帘蛤科，文蛤属，是我国沿海滩涂重要的经济贝类之一。但由于近年来沿海重工业的发展和临港船舶运输等，造成海洋环境污染，文蛤养殖病害不断发生，由此造成巨大的经济损失，也严重影响了贝类养殖产业的可持续发展。目前认为，重金属污染是近年渔业环境污染的公害之一，是导致贝类死亡的直接原因。有关重金属对文蛤抗氧化酶影响的研究已有一些报道，任虹等[10]研究了铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）和铅（Pb）等重金属离子对文蛤肝脏过氧化氢酶（CAT）和细胞色素氧化酶（CCO）2种酶活性的影响；田镇等[11]研究了在铜离子（Cu2+）胁迫下，不同群体文蛤超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力的变化。但重金属对文蛤防御系统分子机制的影响尚未见报道。现克隆了文蛤MmBD基因，分析其特征和组织分布规律，研究了在Cu2+胁迫下，该基因应对环境压力的免疫应答变化，以期为文蛤免疫防御机制研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用文蛤来自江苏省通州湾海区。选取4个健康成熟的文蛤个体，置于冰上麻醉，分别取其外套膜、鳃、肝胰腺、足、闭壳肌以及性腺等6个组织样品。待文蛤性腺发育成熟后，进行催产，获取4细胞期、囊胚期、原肠胚、D形幼虫、壳顶幼虫和稚贝6个不同胚胎发育时期样品。设置对照组与试验组，开展Cu2+胁迫试验。使用CuSO4·5H2O（AR）制备1 g/L Cu2+母液，设置Cu2+质量浓度为0.5 mg/L的海水为试验组，不加Cu2+的正常海水为对照组，每组30个文蛤个体，并设置3个平行试验。每个组分别于12、36和72 h取3个文蛤个体的鳃组织，均用液氮速冻，并置于-80℃冰箱中保存。

1.2 MmBD基因cDNA序列全长克隆及序列分析

从转录组文库中获得MmBD的EST序列，采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）进行基因cDNA序列全长克隆，设计3＇RACE和5＇RACE特异性引物进行扩增（表1），将获得的PCR产物进行纯化、回收，随后连接到pMD-18T（TaKaRa）载体，37℃过夜培养，转化到大肠杆菌DH5α（TaKaRa）中克隆，将筛选的阳性克隆送至生工生物有限公司测序，拼接获得结果。使用ORF Finder、SMART、ExPASY、TMHMM等在线网页和工具，开展序列结构特征分析；使用MEGA 5.0构建系统进化树。

表1 试验所用引物

1.3 荧光定量分析

根据RNA提取纯化试剂盒和反转录试剂盒（天根）的说明书，分别获取各个组织的总RNA，测定OD260/OD280值、1.2%琼脂糖凝胶电泳评估RNA浓度和质量，再将总RNA反转录为cDNA，于-20℃保存。根据荧光定量预混试剂盒（天根）说明书配置体系，同时设置ABI7300系统扩增程序。每个cDNA样品做3个平行，β-actin为内参，扩增产物的解离曲线分析保证扩增质量。荧光定量数据按照文献[12]的2-ΔΔCt方法计算，试验数据均以平均值±标准差（Mean±SD）表示。使用SPSS 19.0软件的单因素方差（One-Way ANOVA）对数据进行分析，在单因素方差分析的基础上，采用Duncan多重比较法进行分析，P＜0.05为结果差异显著。

2 结果与分析

2.1 MmBD基因序列分析

采用RACE技术克隆获得MmBD基因（Gen Bank:ON351576）的cDNA全长序列，共758 bp，其中5＇非翻译区（UTR）长181 bp，3＇UTR长214 bp，开放阅读框（,ORF）长363 bp，共编码120氨基酸（图1）。预测蛋白分子质量为13.22 kD，理论等电点pI为7.55。MmBD的预测氨基酸序列包含1个信号肽（1～23 aa）、2个跨膜结构域（7～24 aa,44～66 aa）、高度保守的Cys残基C-X6-C-X3-C-X13（14）-C-X4-C-C和kex2样蛋白酶（KEKR-AV）的裂解位点。预测蛋白前端信号肽区具有较强的疏水性，在成熟肽区均有疏水氨基酸和亲水氨基酸分布（图2）。预测三级结构包含3个α螺旋和6个β折叠。氨基酸序列对比、系统进化树和系统进化树所用物种序列登录号分别见图3、4和表2。由图3、4可见，文蛤MmBD基因与菲律宾蛤仔的亲缘关系最近，先与菲律宾蛤仔聚为一支，再与牡蛎、贻贝聚为一大支，最后再与扇贝等软体动物聚为一大支。

图1 文蛤Big Defesin基因cDNA全长序列及其结构特征

图2 MmBD亲水性与疏水性分析

图3 文蛤与其他物种Big Defesin基因构建的系统进化树

图4 文蛤MmBD与其他软体物种Big Defesin基因氨基酸序列对比

表2 系统进化树所用物种序列登录号

续表

2.2 MmBD基因的组织表达

使用qPCR（实时荧光定量核酸扩增检测系统）分析MmBD基因在文蛤不同组织中（性腺、鳃、外套膜、肝胰腺、闭壳肌、足）的分布规律，结果见图5。由图5可见，MmBD在所检测的各个组织中均有表达，该基因在鳃组织中的表达量最高（P＜0.05），其次是在外套膜和肝胰腺，而在闭壳肌、性腺和足中的表达量较低。

图5 MmBD基因在文蛤各组织的分布情况

2.3 MmBD基因在胚胎发育时期的表达

MmBD基因在文蛤不同胚胎发育时期（4细胞期、囊胚期、原肠胚、D形幼虫、壳顶幼虫和稚贝）表达见图6。由图6可见，MmBD基因在D形幼虫期表达量最高（P＜0.05），其次是原肠胚期，稚贝期表达量最低（P＜0.05）。

图6 MmBD在不同胚胎发育时期的表达特征

2.4 Cu2+胁迫下MmBD基因的表达特征

高浓度Cu2+胁迫试验结果表明，对照组文蛤的MmBD基因表达量无显著变化，试验组MmBD基因表达量明显升高（图7）。尤其是36和72 h，试验组MmBD基因表达量极显著高于对照组（P＜0.01）。

图7 MmBD基因在Cu2+胁迫下的表达规律

3 讨论

克隆获得了文蛤Big Defensin基因的cDNA全长序列，结果显示，该基因的氨基酸序列N末端是一段具有较强疏水性的信号肽序列（23 aa），主要起到引导防御素前体蛋白通过脂膜的作用[13]；C端包含1个高度保守的防御素结构，该结构由6个特定位置的保守半胱氨酸残基C-X6-C-X3-C-X13（14）-C-X4-C-C组成，这与魁蚶、紫贻贝、海湾扇贝等其他贝类的Big Defensin基因的结构相似，都具有防御素基因家族的典型特征。由此推测，文蛤MmBD基因可能发挥着与其他物种Big Defensin基因相似的功能。

MmBD在不同组织中的表达结果显示，MmBD在性腺、腮等6个组织中均有表达。这与魁蚶[9]、文昌鱼（Branchiostoma japonicum）[14]、杂色鲍（Halitotis diversicolor）[15]等的研究结果相似，Big Defensin基因在不同组织中广泛表达。文蛤MmBD基因在鳃中的表达量最高（P＜0.05），其次是外套膜和肝胰腺。在魁蚶中，Big Defensin基因在肝胰腺中表达量最高，随后是鳃、性腺以及外套膜；在杂色鲍中，Big Defensin基因在肝胰腺中表达量最高，其次是外套膜、足和鳃。在双壳贝类中，鳃组织的主要功能是过滤和呼吸作用，外套膜是暴露于外部环境最多的组织之一，是免疫防御的第一道防线；肝胰腺的主要功能是消化代谢，是一种重要的免疫组织，可合成免疫因子启动免疫反应；这几个组织对调节贝类自身的免疫机制至关重要，可有效抵抗外来有害物质的入侵[16-17]。由此可推测，文蛤MmBD基因与其他物种的Big Defensin基因一样，在鳃、外套膜和肝胰腺等组织器官中起到重要作用，在机体免疫中发挥重要功能。MmBD在不同胚胎发育时期的表达结果显示，MmBD在原肠胚期表达量突然上升，D形幼虫期表达量最高（P＜0.05）。文蛤幼体在原肠胚后期整个胚胎形态逐渐发生变化，形成担轮幼虫，随后再变态形成D形幼虫，D形幼虫开始从外界摄食[18]，MmBD在在原肠胚期开始大量表达，主要在D形幼虫期起到重要作用，这可能是MmBD基因在这一过程中对幼体自身开展的自我保护机制。

防御素主要参与调节机体免疫系统，具有多项免疫功能，是生物体防御系统的重要成分。多项研究报道，Big Defensin基因与软体动物免疫防御密切相关。文献[7，19]研究表明，海湾扇贝和蛤仔（Venerupis philippinarum）面对细菌攻击时，两者血细胞内的Big Defensin基因表达量显著上调，显示出该基因较强的抗菌活性；Li等[9]研究表明，魁蚶SbBDef1基因参与了自身的免疫应答过程，细菌侵染后其血细胞和肝胰腺中的SbBDef1基因均出现大量表达。此外，三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）[20]、栉孔扇贝（Chlamys nobilis）[21]等研究中显示，Big Defensin基因同样在自身的机体免疫中起到重要作用。本试验结果与以往的研究结果相似，文蛤MmBD基因在重金属Cu2+胁迫下出现明显上调，尤其是36和72 h时，试验组MmBD基因表达量约为对照组表达量的5倍，2组差异极显著（P＜0.01）。此结果说明，文蛤MmBD基因响应Cu2+胁迫下的免疫应答，该基因可能在文蛤抵御外界环境刺激时发挥一定功能，其免疫防御机制有待继续深入研究。