乌鳢源维氏气单胞菌的分离鉴定及其生物学特性研究

王晓磊，谭劭雯，李子雁，温际富，刘学美，姜彤彤，隋智海*

（1.临沂大学教育学院，山东 临沂 276000；2.菲律宾克里斯汀大学国际学院，菲律 宾马尼拉 1004；3.临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000；4.齐鲁制药集团有限公司，山东 济南 250000；5.临沂市河东区农业农村局，山东 临沂 276034）

乌鳢（Channa argus），又称“黑鱼”“生鱼”，属鳢亚目，鳢科，鳢属，是一种重要的淡水经济鱼类，主要分布在亚洲和非洲，我国年产量可达50万t[1-2]。但随着养殖密度的不断提高，养殖环境被破坏，导致乌鳢病害频发，制约养殖业的健康发展[3-4]。常见的乌鳢细菌性疾病主要是由诺卡氏菌属（Nocardia）引发的诺卡氏菌病[5]，由气单胞菌属（Aeromonas）引起的坏死性筋膜炎败血症[6]，由爱德华氏菌属（Edwardsiella）引起的爱德华氏菌病[7]等。目前，病害防治主要以化学药物为主，而药物的大量使用，会加速病原菌产生耐药性，成为超级细菌，危害养殖业和生态环境的发展[8-9]。

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种革兰阴性菌，属气单胞菌科，气单胞菌属，兼性厌氧菌，广泛分布在自然界中[10-11]。维氏气单胞菌具有较强的环境适应力，可感染宿主范围较广，包括淡水鱼、两栖动物、鸟类、哺乳动物等[12-13]，目前，已从患病的鲫、罗非鱼、虹鳟、鲤等中分离并鉴定，成为威胁鱼类养殖业的病原菌之一[14-16]。在维氏气单胞菌感染发病过程中，其毒力因子如：气溶素、丝氨酸蛋白酶、细胞毒性肠毒素、细胞毒性肠毒素和黏附因子，发挥着重要作用[17-18]。因此，随着分离株日趋多样化，确定临床维氏气单胞菌分离株毒力相关因素，对了解其发病机理和流行病学至关重要[19]。

现从患病乌鳢肝脏、脾脏和肾脏等组织混合样品中，分离并纯化出一株优势菌株，采用革兰染色、16S rRNA和gyrB基因鉴定、生理生化试验等多种方法，确认此优势菌株是维氏气单胞菌。通过最适温度和最适pH值测定、药敏试验和毒力基因扩增分析，进一步了解评估其环境适应力、耐药特性及其致病机制，拟为维氏气单胞菌感染的预防和治疗提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021年4月，从山东省临沂市某乌鳢养殖场取濒临死亡的乌鳢，装入无菌袋，放置冰盒中，2 h内运至临沂大学生命科学院食品质量与加工实验室。

1.2 细菌分离、纯化及其形态观察

在无菌条件下，用75%乙醇棉球对乌鳢体表消毒，解剖后剪取部分肝脏、脾脏和肾脏，置于500 μL无菌PBS溶液中，用低速研磨器（北京天根生化科技有限公司）研磨成组织悬液，采用PBS溶液10倍稀释，涂布在LB固体培养基上，置于30℃中培养24 h，观察菌落生长情况。选取优势菌落再次划线接种于LB固体平板上纯化，30℃培养24 h，观察菌落形态特征。

1.3 革兰染色

按照革兰染色液试剂盒（青岛海博生物技术有限公司）说明书，从LB固体培养基上挑取单菌落于蒸馏水中混匀，均匀涂布在载玻片上，经结晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脱色和番红复染，干燥后置于光学显微镜下，用油镜观察其形态特征。

1.4 16S rRNA、gyrB基因序列扩增与系统发育分析

按照细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）说明书，LB液体培养细菌16 h，经离心后，提取其基因组DNA。随后，以其为模板，利用16S rRNA的通用引物27F/1492F和gyrB的引物对gyrB-F/gyrB-R分别扩增16S rRNA和gyrB基因，引物序列见表1[20-21]。PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 25μL，上下游引物各2.5 μL，ddH2O 19 μL，DNA模板1 μL。PCR反应程序为：94℃预变性10 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60～90 s，共30个循环；72℃延伸10 min。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测质量，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

表1 引物序列

经NCBI在线BLAST完成序列同源性分析，选取部分16S rRNA和gyrB基因序列，利用MEGA-X软件采用邻接法（Neighbor-Joining Method）构建系统进化树，分析序列同源性。

续表

1.5 生理生化特性鉴定

按照微量生化反应管（青岛海博生物技术有限公司）说明书，从LB固体平板上刮取菌落，于PBS中混匀，测定菌液在600 nm处的吸光值（OD600），并调至约0.2（0.5麦氏浊度），将50 μL细菌悬液接种至各类微量生化反应管，于30或42℃培养24 h，观察并记录反应管颜色变化，参照说明书鉴定细菌生理生化特性。

1.6 最适温度和最适pH值测定

将细菌接种至LB液体培养基中，过夜培养，5 000 r/min离心，PBS重悬，按照1%接种量转接至新鲜的液体LB中，分别置于25，30，37和40℃摇床中培养48 h，每个温度设置3个重复，每隔2 h测定OD600值，取平均值作为最终结果。以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制生长曲线，确定最适温度。随后按照1%的接种量，分别转接至pH值为5，6，7和8的新鲜液体LB中，置于37℃摇床中培养48 h，每个pH值设置3个重复，每隔2 h测定吸光值OD600，取平均值作为最终结果。绘制生长曲线，确定最适pH值。

1.7 药物敏感性试验

采用Kirby-Bauer纸片扩散法，测定细菌药物敏感性。用37℃震荡液体过夜培养细菌，用无菌PBS稀释至0.5麦氏标准浊度，涂布100 μL菌液于LB平板，贴上药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司产品），置于37°C恒温培养24 h后，测量抑菌圈直径（mm），重复3次，取平均值。根据产品说明书，判定分离菌株的耐药程度。

1.8 毒力基因检测

以细菌基因组DNA为模板，参照文献[23]合成引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，分别扩增检测细胞毒性肠毒素基因（act）、菌溶素基因（aer）、脂肪酶基因（lip）、丝氨酸蛋白酶基因（ser）、热不稳定肠毒素基因（alt）、热稳定肠毒素基因（ast）和鞭毛蛋白基因（fla）和弹性蛋白酶基因（ahyB）等8种维氏气单胞菌毒力基因。反应程序：94℃预变性10 min；94℃变性30 s、退火温度（表1）30 s、72℃延伸20～30 s，30个循环；72℃延伸10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。随后，PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，经NCBI的Blastn比对，鉴定其序列是否正确，以确定菌株的毒力基因。

2 结果与分析

2.1 病原菌菌落形态及革兰染色

从乌鳢病变内脏组织中分离得到一株优势菌株（暂命名为WL-3）。将WL-3接种在LB固体培养基上，37℃过夜培养，可形成圆形、中间隆起、边缘整齐、表面光滑湿润且半透明的淡黄色菌落[图1（a）]。经革兰染色，WL-3在油镜下呈现红色、短杆状、两端钝圆的特征，是一种革兰阴性菌[图1（b）]。

图1 菌株WL-3

2.2 16S rRNA和gyrB序列分析及系统发育分析

以WL-3基因组DNA为模板，利用引物对27F/1492F和gyrB-3F/gyrB-14R分别扩增16S rRNA和gyrB基因，结果见图2（a）（b）。由图2可见，16S rRNA扩增条带大小约为1 500 bp，gyrB扩增条带大小约为1 100 bp，均与预期目的片段大小一致。

图2 基因PCR扩增

16S rRNA和gyrB基因序列经NCBI的Blastn比对分析见图3（a）（b）。由图3可见，均显示菌株WL-3与维氏气单胞菌的相似度最高，分别为99.70%（16S rRNA）和99.81%（gyrB）。从中选取部分同源性较高的同属菌株序列，利用Mega-X构建NJ系统进化树，显示菌株WL-3与维氏气单胞菌自然聚在一支中。

图3 基因序列的系统发育进化树

2.3 生理生化特性

生理生化鉴定结果见表2。由表2可见，菌株WL-3可利用葡萄糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇和乳糖等5种碳源；精氨酸双水解酶、V-P试验等2项指标均呈阳性反应；在无盐和3%NaCl胰胨水中生长；但纤维二糖、阿拉伯糖、鼠李糖、尿素酶、明胶酶、氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、6%～10%NaCl胰胨水、42℃生长等13项试验结果为阴性。

表2 菌株WL-3的生理生化特性①

续表

2.4 药敏试验结果

用药敏纸片法测定菌株WL-3对30种抗生素的敏感性，结果见表3。由表3可见，该菌对氨苄西林、多西环素、卡那霉素、红霉素、四环素、复方新诺明等12种药物有较强耐药性；对庆大霉素、环丙沙星等2种抗生素中度敏感；对头孢唑啉、头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、丁胺卡那、新霉素、氯霉素、氧氟沙星等16种抗生素高度敏感。结合临床用药原则，可考虑适当使用硫酸新霉素粉（水产用）来进行防治。

表3 分离菌株WL-3药敏试验结果①

2.5 部分毒力基因检测

菌株WL-3的毒力基因扩增PCR产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4。由图4可见，aer、alt、ahyB、act可以扩增出单一条带，与预期大小一致，而lip、ser、ast、fla没有扩增条带。随后对目的条带进行测序，经Blastn比对，其序列与肠毒素、脂肪酶、蛋白酶以及血溶素基因相似度达到100%，表明该菌株携带了多种毒力基因。

图4 分离菌毒力基因PCR扩增结果

2.6 最适温度和最适pH值测定

菌株WL-3在不同的温度和pH值下的生长情况见图5。由图5可见，25～37℃时，菌株WL-3均能生长，最适温度是37℃，42℃时不能生长；pH值为5～8时，均能生长，最适pH值为7。

图5 分离菌株WL-3在不同温度和pH值生长曲线的测定

3 讨论

3.1 病原菌的分离和鉴定

截至目前，已从患病乌鳢中分离得到不同种类病原菌，如杀鱼爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌等[23-26]，其中，维氏气单胞菌是一种人、兽、鱼共患病原菌，广泛分布在自然界中，既可感染鱼类、引发败血病和溃疡综合征等，也可以感染人类、引发败血症和胃肠炎等症状[27]。

针对临沂市某乌鳢养殖场暴发皮肤溃烂病，从患病乌鳢体内分离纯化得到一株优势的革兰阴性菌株WL-3，其生理生化特性与草鱼源维氏气单胞菌16-1、鲫源维氏气单胞菌CFJY-623和维氏气单胞菌ATCC 35624既相似，又不同[22，28]。虽然生理生化特征分析在细菌鉴定中十分常用，但也存在难度较高且准确性低的缺陷，需要结合分子鉴定法[29]。16SrRNA和gyrB均为保守基因，存在于所有细菌中，是区别细菌种属关系最有效和最精确的方法之一[30]。经Blast比对和系统发育树分析，菌株WL-3的16SrRNA和gyrB基因序列与已知的维氏气单胞菌同源性最高，并且与维氏气单胞菌聚在一支中。因此，鉴定此分离菌株为维氏气单胞菌WL-3。

3.2 致病性与致病机理

气单胞菌毒力因子，如生物活性因子、黏附因子、水解酶和肠毒素等，与其致病性息息相关，也是评估其潜在致病性的良好指标之一[31]。菌株WL-3的毒力基因检测显示，其携带了aer、alt、ahyB、act等4种毒力基因，分别编码菌溶素、热不稳定肠毒素、弹性蛋白酶和细胞毒性肠毒素。菌溶素通过与糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白结合，破坏宿主的细胞膜，引发细胞凋亡[32]。弹性蛋白酶通过破坏和降解宿主免疫蛋白，加速其感染和定植[33]。肠毒素具有溶解红细胞、破坏组织细胞系、在结扎肠环模型中引起液体分泌反应等生物学活性功能[34]。菌株携带毒力因子多少与致病性强弱有一定相关性，说明该菌株具有潜在致病性,但毒力基因与其致病机理的关系还需进一步研究。生长曲线测定显示，该菌株可以在不同的温度、pH值和NaCl浓度（≤3%）下生长，具有较强的环境适应能力，这与维氏气单胞菌CFJY-623相似[22]。这些结果有助于了解气单胞菌的发病机制和流行病学特征，继而评估感染引发病害的风险。

3.3 病害的预防及控制方法

目前治疗皮肤溃烂病、烂鳃病、出血症等鱼类疾病的主要方法仍然是使用抗菌药物。经药敏试验发现，维氏气单胞菌WL-3对氨苄西林、多西环素、卡纳环素、红霉素、四环素等多种药物有较强抗性，但对头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢呋辛、头孢他啶、丁胺卡那、新霉素、氯霉素等药物敏感。可根据水产用药规定，选择合适的敏感药物，如硫酸新霉素粉（水产用）进行相应的治疗。