白玉豆中α-淀粉酶抑制剂的提取、纯化及其性质研究*

崔彦阁，许军星，李 琳，张 萍，孙 路

（河北省衡水市第二人民医院，河北 衡水 053000）

引 言

白玉豆是豆科菜豆属一年或多年生草本植物，其外形圆润，色泽洁净如玉，因此得名。其主要产于我国江西、浙江、福建等长江中下游省份，有着悠久的种植历史[1]。根据农产品检测机构的测试显示，白玉豆的营养价值高，含有α-AI、多种氨基酸、抗性淀粉和微量元素等多种对人体有益成分，能够起到排毒养颜、开胃消炎等作用[2]。

α-AI 进入人体会抑制人体胰腺分泌的α- 淀粉酶（α-1,4- 葡聚糖-4- 葡聚糖水解酶）的催化作用，抑制人体吸收的淀粉或糖原转变为葡萄糖的过程，能有效治疗2 型糖尿病患者餐后的高血糖[3～5]。而且α-AI 被人体摄入后还会抑制小肠中的胰淀粉酶的催化作用，抑制人体对食品含有的淀粉的吸收，有利于减少体脂。从多种植物中提取α-AI 并纯化的工艺已有所开展，并且已有多种检测及试验证实了其对糖尿病的预防和治疗功效[6～7]。陈一昆等[8]提取芸豆中的α-AI 用于SD 大鼠，验证了α-AI降低脂肪减轻体重的功效；Shi 等[9]通过将α-AI 添加到高脂饮食诱导的肥胖的大鼠的饮食中，肥胖大鼠的体重增长减缓且肠道微生态得到了改善；Wang等[10]发现α-AI 仅会减少体脂降低血糖浓度，并不会引起显著的临床变化和不良反应，对人体安全。为拓宽α- 淀粉酶抑制剂获取途径，同时提高白玉豆的加工附加值，本文对从白玉豆中获取α-AI 的条件及产物性质进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

白玉豆（市售）；猪胰α- 淀粉酶、可溶性淀粉、BCA 蛋白检测试剂盒（Sigma 公司）；氯化钠（阿拉丁试剂有限公司）；食用乙醇（上海生工生物工程技术服务有限公司）；3,5- 二硝基水杨酸（阿拉丁试剂有限公司）。

冷冻离心机（Allegra X-30R，beckmancoulter 公司）；真空冷冻干燥机（FD-1B-55，博医康实验仪器有限公司）；pH 计（DELTA320，梅特勒- 托利多仪器）；电子天平（BS 224 S，赛多利斯仪器）；紫外可见分光光度计（TU-1800，普析通用仪器）；可见分光光度计（722s，上海精密科学仪器）；粉碎机（JZ7114，上海微型电机厂）；恒温水浴锅（DZKW-D-2，天津天泰仪器有限公司）；真空旋转蒸发仪（R-200，B CHI）；层析柱（自制）；酶标仪（SpectraMaxR 190，美谷分子仪器有限公司）；恒温培养箱（DNP-9082，上海精宏试验设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 白玉豆中α- AI 抑制剂的提取与纯化

将白玉豆在24℃去离子水中清洗后粉碎。称取200g 粉碎后的白玉豆过60 目筛，溶于1L 的1.5%(wt)的氯化钠溶液中室温浸提4h，经过滤后混合滤液。将滤液经过20min 水浴加热至70℃，按4000r/min 转速离心0.5h，收集上层的清液。在清液中添加食用乙醇，得到70%食用乙醇的混合液，在4℃下静置1h，之后以10000r/min 转速离心15min，取出沉淀物，为提取的白玉豆α-AI 的粗品。

将适量的白玉豆α-AI 粗品用定量的0.025mol/L（pH 值为4.5）HAc-NaAc 缓冲液充分溶解，混合溶液使用CM 纤维素柱层析（2.6cm×40cm），之后用0～1mol/L NaCl 的0.025mol/L（pH 值为4.5）HAc-NaAc 洗脱液以1mL/min 流速梯度洗脱，收集蛋白峰并逐一检测α-AI 活性，收集蛋白峰与α-AI 抑制活性峰重合的洗脱液，透析浓缩冷冻干燥后进一步纯化。用SephedexC-75 凝胶柱层析（1.0cm×80cm）以及含0～1mol/L NaCl 的0.025mol/L（pH 值为4.5）HAc-NaAc 溶液以0.5mL/min 的流速进行梯度洗脱，发现突出的蛋白主峰，逐一检测α-AI 活性。收集蛋白峰与α-AI 抑制活性峰重合的洗脱液，经透析浓缩后冷冻干燥，得到α-AI 样品。

1.2.2 α- AI 的温度及酸碱稳定性研究

为准确分析温度及酸碱度对α-AI 的影响，以试验用的α-AI 溶液配置质量浓度约0.6mg/mL 稀溶液，标准状态下的α-AI 对猪胰腺α- 淀粉酶的抑制率在65%～85%。在25，35，45，55，65，75 和85℃与pH 值1～12 (pH 梯度为1) 的条件下进行α-AI 的温度和酸碱稳定性研究。

1.2.3 α- AI 的提取单因素试验

在白玉豆中α-AI 的提取与纯化方法中，影响α-AI 提取与纯化的变量分别为固定豆粉的细度、料液比和盐溶时间，以此进行单因素试验分别研究各因素的影响。试验条件设为：豆粉的细度60 目，提取时间10h，溶剂比例1∶10g/mL。单因素的试验条件为豆粉细度（40，60，80，100 和120 目）、提取时间（2，4，6，8 和10h）和溶剂比例（1∶5，1∶10，1∶15 和1∶20（g/mL））。判断指标选择半数抑制浓度IC50。

淀粉在α- 淀粉酶的催化作用下发生水解，产生可将3,5- 二硝基水杨酸（DNS）还原的麦芽糖和葡萄糖[11]，因此通过淀粉水解产生的麦芽糖含量来衡量α-AI 对α- 淀粉酶的抑制效果。吸光度（y）与麦芽糖标准溶液浓度（x） 的关系为[12]y=7.653x-0.5687（R2=0.9973）。

样品测定：将50μL 淀粉酶溶液（2mg/mL）与添加100μL 稀释后α-AI 和200μL PBS 缓冲溶液充分混合，恒温水浴20min（37℃）后加入400μL 可溶性淀粉（5mg/mL），再恒温水浴10min（37℃），添加250μL 的DNS，沸水浴10min 后空冷至室温，在520nm 处测量其吸光度。在试验过程中，另外设置标准组、标准对照组和试验对照组，标准组中不添加α-AI，标准对照组中不加淀粉酶液和α-AI，试验对照组中不加淀粉酶液，体积通过PBS 控制到相同水平。α-AI 抑制率P 通过式（1）计算[13]。

其中A1、A2、A3和A4分别为波长520nm 下标准组、标准对照组、试验组和试验对照组的吸光度。通过α-AI 浓度和P 的关系可以得到α-AI 对猪胰淀粉酶的半数抑制浓度IC50。

1.2.4 α- AI 的沉淀条件的确定

水溶液中的白玉豆α-AI 可以使用有机溶剂作为沉淀剂沉淀分离，常用的有机溶剂有甲苯、乙醇、异丙醇等。由于α-AI 的主要用途是合成减肥食品与糖尿病药物，从人体安全角度考虑，选择乙醇作为沉淀剂。在白玉豆提取液中分别添加占终溶液体积分数为30%，50%，70%和90%的食用乙醇，经过一定时间的沉淀反应后检测上层清液中的α-AI 活性，结果显示含70%乙醇的混合溶液的上层清液不含α-AI。

2 结果与分析

2.1 CMII 纤维素离子交换柱层析结果

本研究通过进行CMII-cellulose 对白玉豆α-淀粉酶抑制剂的层析预试验，确定层析过程中的参数为试验方法中所设，层析时每管采集5mL。层析过程的洗脱曲线如图1 所示。

从图1 可知，白玉豆α-AI 粗品经过CMII-cellulose 离子交换柱层析，得到1 个蛋白主峰，通过对每管进行α-AI 的抑制活性进行测试，发现蛋白主峰同活性尖峰重合，采集α-AI 的抑制活性大于50%的洗脱液，透析浓缩冷冻干燥，得到α-AI初步纯化样品。

图1 白玉豆α-AI CMII 纤维素离子交换柱层析洗脱曲线（2.6cm×40cm）Fig. 1 The CMII cellulose ion exchange column chromatography elution curve of Baiyu bean α-AI (2.6cm×40cm)

2.2 SephadexG-75 凝胶柱层析结果

将α-AI 初步纯化样品进行SephadexG-75 纤维素离子柱层析，结果如图2 所示。结果发现蛋白主峰同活性尖峰重合，采集α-AI 的抑制活性大于50%的洗脱液，透析浓缩冷冻干燥，得到α-AI 纯化样品。

图2 白玉豆α-AI SephadexG-75 凝胶柱层析洗脱曲线（1.6cm×90cm）Fig. 2 The SephadexG-75 gel column chromatography elution curve of Baiyu bean α-AI (1.6cm×90cm)

2.3 α-AI 的温度及酸碱稳定性试验结果

温度对α-AI 抑制率的影响如图3（a）所示。在25～75℃时，α-AI 对猪胰腺α- 淀粉酶抑制率均大于82%，且波动不大，温度超过75℃后，对猪胰腺α- 淀粉酶抑制率急剧下降，证明α-AI 是一种非热敏性蛋白。因此可以在纯化过程中进行70℃水浴加热以去除热敏性蛋白而不影响α-AI。

图3（b）显示α-AI 在不同pH 值环境下对猪胰腺α- 淀粉酶抑制率，表征α-AI 在不同pH 值的稳定程度。结果显示，α-AI 在pH 值3.0～10.0 之间抑制率较高活性较好，可以稳定存在，在pH 值6.0～8.0 之间其抑制率最大，在pH 值为2 与pH 值大于10 时其活性损失较大，但可以表现出一定抑制特性。

图3 温度（a）和pH 值（b）对α-AI 稳定性的影响Fig. 3 The effects of temperature (a) and pH (b) on the stability of α-AI

FerlS 等[14]在黑豆中分离出在pH 值为3.0～4.0时稳定的α-AI；Hideki 等[15]通过对日本TEPRA Bean 进行提取，得到在pH 值3.0～7.0 具有较高稳定性的α-AI。试验分离得到的α-AI 与文献报道相比，对pH 值的稳定区间更大，使用范围更广。

2.4 α-AI 提取的单因素试验结果

豆粉的细度对α-AI 半数抑制浓度的影响如图4（a）所示。结果表明，随着豆粉细度增加，IC50呈现V 字型变化，先减小后增大，在细度60 目时IC50达到最小值，α-AI 活性最高。这种现象的原因可能在于随着细度增加，提取过程中豆粉的表面积不断增大，接触的氯离子增多，α-AI 盐溶效果增强，表现出IC50下降；这种效果在细度较小时细度的增加导致的表面积增大比较显著，其存在峰值，超过峰值时，豆粉的细度如果再增加反而会使IC50增加，这是由于豆粉细度的增加伴随着大量的豆粉粉碎，在这个过程中α-AI 会大量损失，同时在提取过程中，豆粉之间的团聚几率也随着豆粉的细度增加而上升，导致提取液与豆粉的有效接触面积降低，减少了提取的α-AI 含量，因此豆粉细度过大才会出现α-AI 的活性降低，IC50增加。

料液比对α-AI 的半数抑制浓度的影响如图4（b）所示。IC50的数值随料液比的下降呈先减小后增大趋势，在料液比为1∶10(g/mL)时达到最小值，此时α-AI 活性最高。原因可能在于提取溶剂不仅会提取α-AI 也会提取其他蛋白质，当提取溶剂达到一定比例时α-AI 的提取量达到峰值，此时提取溶剂增加,α-AI 提取量不变,其他蛋白质的提取增加，造成α-AI 在总蛋白含量中的比例减少，使得IC50提高。提取溶剂含量过高反而对后期浓缩不利，因此料液比1∶10(g/mL)为提取α-AI 的最佳料液比。

提取时间对淀粉酶抑制剂的活性影响如图4（c）所示。α-AI 对淀粉酶的IC50值随着提取时间的推移先减小后略有上升，提取时间8h 时达到最低值，原因可能是提取时间增加有利于α-AI 的析出，但盐溶时间过长也会导致部分结构不稳定的杂质蛋白同样析出，使α-AI 的含量比例下降，造成抑制活性下降，IC50值出现上升趋势。因此提取时间选择8h 为宜。

图4 豆粉的细度（a）、料液比（b）和提取时间（c）对α-AI 活性影响Fig. 4 The effects of bean powder fineness (a), material-liquid ratio(b) and extraction time (c) on the activity of α-AI

3 结 论

试验从白玉豆中提取α-AI 并进行纯化，评价其温度和酸碱稳定性，结果表明，α-AI 为耐热性蛋白，在温度75℃以上时，该样品的抑制活性才急剧下降，在pH 值3～10 范围内能够稳定发挥作用。通过单因素试验得到从白玉豆提取α-AI 最佳提取工艺：豆粉细度60 目、料液比1∶10(g/mL)、盐溶时间8h。白玉豆提取的α-AI 可通过CMII 纤维素离子交换柱层析与SephadexG-75 凝胶柱层析纯化。