不同脂肪酶分解甘油三脂效果对比

李博，张磊，杜京尧，李春艳，杨莉莉

（郑州安图生物工程股份有限公司，河南 郑州 450016）

甘油三脂（TG）的代谢分为合成及分解分为人体途径和体外生物工程途径。人体途径中，脂肪组织中的甘油三酯在一系列脂肪酶的作用下，分解生成甘油和脂肪酸，并释放入血供其它组织利用的过程，称为脂动员。甘油三酯分子是细胞内和血浆中脂肪酸储存和运输的主要形式［1］。甘油单脂和长链脂肪酸被吸收后，先在小肠细胞中重新合成甘油三酯，并和磷脂、胆固醇和蛋白质形成乳糜微粒（chylomicron），由淋巴系统进入血液循环［2］，从而被身体当做能量储存［3］。生物工程途径主要是通过微生物或者工业来源的脂肪分解酶直接分解甘油三脂为甘油和脂肪酸；或者脂肪合成酶把甘油和脂肪酸合成甘油三脂［4］。微生物脂肪酶具有水解三酰基甘油的多种催化功能，具有重要的商业价值［5］。其中，来自极端微生物的脂肪酶具有较好的工业应用前景［6］。在成功用于聚合物合成的酶中，南极洲假丝酵母脂肪酶B（CAL-B）是迄今为止文献中最著名的酶。在大多数报道的酶聚合反应中，它被用作固定化酶是因为它具有易于分离和坚固性等优点。Novozym 435是一种市场上可获得的多相生物催化剂，由物理固定在大孔聚（甲基丙烯酸甲酯）树脂内的CAL-B组成，并由Novozymes 进行标记。由于其体外酯交换的潜力，Novozym 435 已被广泛应用于合成聚酯结构［7］。微生物脂肪酶（EC 3.1.1.3）催化长链甘油三酯的水解［8］。可以从细菌属芽孢杆菌属、无色杆菌属、碱生菌属、节肢杆菌属、假单胞菌属和真菌属青霉菌属、镰刀菌属、曲霉菌属等进行了大规模的脂肪酶生产筛选。脂肪酶作为一种多用途的生物催化剂，在生物柴油、食品和饮料、皮革、纺织、洗涤剂、制药和医疗等多个行业的需求中具有广泛应用［9］。本文主要对比不同人血浆中血脂四项的指标差异、5 种微生物脂肪酶效价及分解甘油三脂的效果，并综合相关文献报道，比较微生物脂肪酶的的优劣。

1 材料与方法

1.1 一般资料

①购买自不同厂家的5 种脂肪酶1，脂肪酶2，脂肪酶3，脂肪酶4、脂肪酶5。②选取2019年1 月至2021 年10 月收集的高血脂样本及正常血脂样本共32例。

1.2 试剂与仪器

试剂：①血脂检测：安图（北京）生物技术有限公司血脂四项［TG，批号：10427c11；总胆固醇（TC），批号：01228E11；高密度脂蛋白（HDL），批号：10222A11；低密度脂蛋白（LDL），批号：10223A11］。②脂肪酶活性检测：脂肪酶（LPS）活性检测试剂盒，安图（北京）生物技术有限公司（批号：10315A11）。配套仪器：东芝全自动生化分析仪TBA-2000FR。③温育设备：隔水式电热恒温培养箱PYX-DHS-500-BS-Ⅱ。

2 结果

2.1 不同样本中血脂四项的含量比较

选取2019 年1 月至2021 年10 月收集的高血脂样本及正常血脂样本共32例，使用东芝血脂四项试剂检测。见表1。

表1 不同样本中血脂四项的含量比较（mmol/L）

32 例样本中筛选出23 例高甘油三脂样本，但是这些样本中TC、HDL 及LDL 均在正常值范围，从这些样本检测结果可看出高甘油三脂样本中的TC、HDL 及LDL 含量并不高。TG 与TC、HDL 及LDL 无显著相关性。

2.2 不同脂肪酶效价比较

使用纯化水把5 种脂肪酶均配制成脂肪酶母液，再用脂肪酶含量29.4 u/mL 的阴性血清稀释5种（每个3 个梯度）脂肪酶，然后检测5 种（每个3 个梯度）脂肪酶的酶浓度。见表2。

表2 不同脂肪酶效价比较

不同脂肪酶效价差别很大，比较5 种脂肪酶效价（使用活性），脂肪酶1 效果最好。

2.3 脂肪酶处理高血脂样本效果

不同浓度脂肪酶1 加入样本32（高血脂TG：3.18 mmol/L；TC：2.03 mmol/L；HDL：0.42 mmol/L；LDC：0.82 mmol/L）中，混匀后放置到恒温试培养箱，37℃孵育30 min。脂肪酶1 处理高血脂样本50 u/mL 与100 u/mL 无显著差异，选择50 u/mL 比较合适。见图1。

图1 脂肪酶处理高血脂样本效果图

3 讨论

32 例样本中筛选出23 例高甘油三脂样本，但是这些样本中TC、HDL 及LDL 均在正常值范围，从这些样本检测结果看高甘油三脂样本中的TC、HDL 及LDL 含量并不高。TG 与TC、HDL 及LDL无显著相关性。不同脂肪酶效价差别很大，比较5种脂肪酶效价（使用活性），脂肪酶1 效果最好。脂肪酶1 处理高血脂样本50 u/mL 与100 u/mL 无显著差异，选择50 u/mL 比较合适。

TG 作为主要的能源储备［10］。合成及分解途径在人体内及体外工业化的途径区别如下：人体内的合成与体外工业化手段相比：①合成途径［11］：人体合成甘油三脂需要：三种合成酶，一步步进行，并且每种合成酶均有同工酶，最初的合成起点不同，所用的合成通路也不同［12］。体外工业化的手段是使用同种效用的不同酶及代谢途径单一。②分解途径［8］：人体合成甘油三脂的分解需要三种酶（甘油三酯脂肪酶、甘油二酯脂肪酶和甘油单酯脂肪酶），且第一个酶最为重要，为反应的限速酶，反应过程受到各种调控因子的作用［13］。人体途径的有序进行直接影响人体健康［14］。但是体外工业化的分解途径用的酶不需要任何辅酶因子直接水解甘油三脂为甘油和脂肪酸，它是经过酶工程修饰及改造的酶，改变其某些性质、提高其活性，以便更好地发挥其催化功能，无论是物化性质，还是生物活性都得到了改善［15］。与传统的脂质降解过程相比，微生物具有在温和条件下生物降解脂质废物的能力，有效地产生脂质分解酶，从而实现环境可持续性［16］。酯键合合成塑料、农药、杀虫剂和对羟基苯甲酸酯的水解是当前形势下的一个新兴方向，也用于生物能源的生产和能源节约，以维持全球的危险废物。另一个重要方面是利用与微生物脂肪酶有关的低能耗酶催化生产高附加值产品。对于治疗和诊断辅助的设计，脂肪酶已经变得更加广泛，并正在迅速发展为目前的主要候选人。在医药和医学应用方面，脂肪酶被用作调节剂，如激活剂和抑制剂，特别用于处理生活方式疾病，如肥胖［17］。在目前，调节剂对治疗有巨大的影响，并将在即将到来的未来进一步扩大。因此，这些脂肪酶的使用显著地提高了许多以生物技术为基础的产品［18］。本文通过高血脂样本的筛选，5 种不同脂肪酶的酶活测定及脂解高血脂样本的效果，评价筛选出1 种脂肪酶可用于高血脂样本的体外酶解，改善体外诊断试剂中高血脂样本的干扰，提高检测准确性。